促红细胞生成素对慢性脑缺血大鼠脑组织促凋亡相关蛋白表达水平的影响

严 澎，杨 斌，李文波，何玉清，阮春云

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)又称红细胞因子与促红素，为人体内源性的糖蛋白激素，主要通过与其受体结合起作用，具有刺激红细胞生成的功能[1]。既往研究显示EPO不仅在胎儿的肝脏、成年人的肾脏中表达，也在非造血系统表达，如神经元、血管内皮细胞以及胶质细胞。近年来，研究显示EPO与脑缺血疾病的进展有关，早期运用外源性的EPO对缺氧缺血性新生大鼠的脑损伤有神经保护作用[2]。本研究通过双侧颈总动脉永久性结扎法建立慢性脑缺血大鼠模型，探讨EPO对慢性脑缺血大鼠脑组织凋亡与促凋亡蛋白表达水平的影响，为临床治疗慢性脑缺血病人的药物设计提供动物实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 兔抗鼠Caspase-3抗体(上海优宁维公司生物科技有限公司)，兔抗鼠Bax抗体(上海优予生物科技有限公司)，兔抗鼠Bcl-2抗体(上海恒斐生物科技有限公司)，小鼠抗人Omi/HtrA2抗体(艾美捷科技有限公司)，ECL试剂盒(上海经科化学科技有限公司)，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(TUNEL)试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒(上海研谨生物科技有限公司)，EPO(Theramabs)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma)。冷冻离心机3K15(Sigma)，正置荧光显微镜FM-51D(上海绘统光学仪器有限公司)，全自动轮盘式切片机(LEICA)。

1.2 实验动物 无特定病原体(SPF)级健康雄性16～20周龄SD大鼠96只，体重250～300 g，购于武汉大学中南医院动物实验中心，许可证号：SYXK(鄂)2015-0025，购回饲养1周，再用于后续实验，饲养温度维持在20～25 ℃，空气湿度为50%～55%，光照为人工光照，昼12 h、夜12 h，所有大鼠全天饮水自由。

1.3 模型制备与动物分组处理 采用双侧颈总动脉永久性结扎法建立慢性脑缺血大鼠模型，选取24只SD大鼠，随机分为对照组与假手术组，每组12只，再选取30只SD大鼠作为建模组，用于建立慢性脑缺血模型。建模组大鼠于建模前12 h禁食，腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥钠，颈部正中进行纵向切口，玻璃分针分离双侧颈总动脉，双线结扎，电刀切断颈总动脉防止复流，碘伏消毒，缝合切口，腹腔注射1×105U青霉素，防止感染，术后24 h内苏醒大鼠纳入研究，未苏醒大鼠剔除，本研究共剔除6只大鼠，剩余大鼠随机均分为模型组与EPO组，每组12只。假手术组大鼠除不进行结扎血管，剩余操作与建模组大鼠相同，对照组不做任何处理。

造模成功0.5 h后，EPO组大鼠腹腔注射EPO 5 U/(g·d)，连续注射2周，模型组、假手术组大鼠腹腔注射同体积的生理盐水，对照组大鼠不予任何处理。连续给药结束后，每组大鼠一部分用于神经功能评分、学习记忆能力测试，剩余大鼠用于其他实验指标检测。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能评分 采用Longa 5级评分法评估药物干预后大鼠神经功能评分：无神经缺损症状计0分；不能伸展右侧前爪计1分；行走时向右侧转圈计2分；行走时向右侧倾倒计3分；不能自发行走，意识丧失计4分。

1.4.2 Morris水迷宫实验测定逃避潜伏期与空间记忆能力 每组随机选取6只SD大鼠用于Morris水迷宫实验，该实验包括隐蔽平台实验与空间探索实验。隐蔽平台实验每只SD大鼠训练量为每日3次，共5 d，观察并记录每只SD大鼠到达平台时间(逃避潜伏期)，训练3次的平均值作为该天的成绩；隐蔽平台实验训练5 d后，撤去平台，观察并记录每只SD大鼠在120 s内穿过平台次数，用于检测大鼠的空间记忆能力。

1.4.3 氧化应激指标检测 末次给药1 h后，采用1%戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，取出完整的脑组织，一部分用于脑匀浆制备，2 000 r/min、10 min，取上清液存储于-80 ℃环境中，采用ELISA法检测大鼠脑组织中的MDA含量及SOD、CAT、GSH活性，操作严格参照试剂盒说明进行。剩余脑组织一部分保存于-80 ℃环境中用于蛋白水平检测，另一部分固定于4%多聚甲醛用于苏木精-伊红(HE)染色与TUNEL检测。

1.4.4 HE染色与TUNEL检测 处死大鼠，将脑组织置于4%多聚甲醛中固定，进行常规石蜡包埋，一部分用于HE染色，另一部分根据免疫组织化学试剂盒说明书操作用于TUNEL检测，在显微镜下观察并采集图像。在TUNEL法检测过程中，随机选取10个视野，记录100个细胞中阳性细胞数，统计各组细胞凋亡率，细胞凋亡率=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.4.5 蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测 提取各组大鼠脑组织总蛋白，采用Bradford调整蛋白浓度相同，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，再用TBST缓冲液漂洗40 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶500)孵育1 h，参照ECL试剂盒操作说明观察膜上蛋白条带，收集影像。

2 结 果

2.1 各组神经功能评分、逃避潜伏期及穿越平台次数比较 与假手术组相比，模型组神经功能评分增加(P<0.05)；与模型组相比，EPO组神经功能评分降低(P<0.05)。与假手术组相比，模型组逃避潜伏期延长(P<0.05)，120 s穿越平台次数减少(P<0.05)；与模型组相比，EPO组逃避潜伏期缩短(P<0.05)，120 s穿越平台次数增加(P<0.05)。详见表1。

表1 各组神经功能评分、逃避潜伏期及穿越平台次数比较 (±s)

2.2 各组大鼠脑组织SOD、CAT、GSH及MDA含量比较 与假手术组相比，模型组脑组织中SOD、CAT、GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；与模型组相比，EPO组脑组织中SOD、CAT、GSH水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑组织SOD、CAT、GSH及MDA含量比较 (±s)

2.3 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况比较 对照组与假手术组大鼠脑组织神经元结构完整、排列整齐、细胞核大且圆；模型组大鼠脑组织中神经元排列紊乱、核固缩、细胞体积减小且形状不规则；EPO组大鼠脑组织中神经元的形态结构较模型组改善较多，细胞排列整齐，细胞核固缩较少。详见图1。对照组与假手术组大鼠脑组织TUNEL染色阳性细胞较少，其次为EPO组、模型组。详见图2。模型组大鼠脑组织细胞凋亡率高于对照组、假手术组及EPO组(P<0.05)，对照组与假手术组大鼠脑组织细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

图1 各组大鼠脑组织HE染色结果(×200)

图2 各组大鼠脑组织TUNEL检测结果

表3 各组大鼠脑组织细胞凋亡率比较 (±s) 单位：%

2.4 各组大鼠脑组织Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2、Bcl-2蛋白水平比较 与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中的Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平均明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明显下降(P<0.05)，对照组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，EPO组大鼠脑组织中的Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。详见图3、表4。

图3 各组大鼠脑组织Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白凝胶成像结果

表4 各组大鼠脑组织Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白水平比较 (±s)

3 讨 论

脑缺血是由多种因素引起的脑供血不足所致的神经系统疾病，慢性脑缺血是其中常见的病理状态之一，常伴发于多种神经系统疾病进程中，如脑供血不足、皮质下动脉硬化性脑病、缺血导致的脑白质损害以及脑萎缩等[3]。EPO属于造血细胞因子超家族成员，为含有唾液酸的酸性糖蛋白，主要由蛋白质、糖类组成，有4个糖基化位点。EPO与其受体(EPOR)结合后使其构象发生变化，能够使JAK2络氨酸激酶激活，使EPOR的多个络氨酸残基磷酸化，激活下游多个信号通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶、有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及Janus激酶2(JAK2)-信号转导子等[4]。临床研究显示，EPO在开颅动脉瘤夹闭术后脑缺血治疗中效果显著，能够帮助病人术后缺血脑组织微循环重建，改善脑缺血病人临床症状，并对神经功能有保护作用[5]。本研究通过双侧颈总动脉永久性结扎法建立慢性脑缺血大鼠模型以模拟成年人慢性脑缺血症状，并用EPO进行处理，结果显示，EPO可以降低慢性脑缺血损伤大鼠的神经功能评分，还可以提高大鼠的记忆能力。临床研究显示，在高压氧治疗的基础上增加EPO治疗能够改善缺氧缺血性脑病患儿神经行为，改善脑组织的代谢，并且安全性高[6]。本研究结果提示EPO对慢性脑缺血大鼠神经功能有保护作用。

氧化应激在神经、血管性疾病中发挥着重要作用，慢性脑缺血存在慢性低灌注的特点，在此过程中细胞中的线粒体损伤，从而引起组织氧化应激反应，活性氧物质产生，脂质发生过氧化反应，对机体的血脑屏障功能与脑实质造成损伤[7]。同时在机体慢性缺血时，会抑制海马突触的可塑性、沉默信息调节因子(Sirt)活性，参与氧化应激反应以及认知受损过程[8]。本研究结果显示，EPO可以降低慢性脑缺血大鼠脑组织中MDA含量，增加SOD、CAT、GSH水平。MDA是过氧化产物的主要成分之一，过量的自由基及脂质过氧化产物会增加神经细胞结构损伤程度，导致脑组织损伤程度加重；SOD具有清除自由基的能力[9-10]；CAT主要是催化过氧化氢分解成为水和氧；GSH由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，具有抗氧化以及解毒作用。SOD、CAT、GSH共同组成了机体抗氧化的防御系统，其活性均能反映机体的抗氧化应激能力。石境懿等[11]研究显示，重组人促红细胞生成素(rhEPO)可以降低新生儿缺氧缺血性脑病导致的氧化应激损伤。本研究结果表明，EPO可以降低慢性脑缺血大鼠脑组织的氧化应激反应，减少神经组织损伤。

慢性脑缺血后脑组织会出现损伤，氧化应激增强，调控细胞凋亡的特定蛋白水平表达上调。细胞核、线粒体是影响细胞凋亡的重要因素，线粒体损伤使活性氧(ROS)大量产生，影响Bcl、Bax比例，细胞色素C先后与凋亡酶激活因子、Caspase-9结合，激活Caspase-3，破坏细胞核内的DNA修复酶促进细胞凋亡[12-13]。本研究结果显示，EPO可以降低慢性脑缺血大鼠脑组织的细胞凋亡率，还可以降低Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平，增加Bcl-2蛋白含量。Bcl-2是线粒体途径凋亡通路中的重要成员，其高表达可以抑制多种因素导致的细胞凋亡，而Bax属于促细胞凋亡基因，两者比值大小可以直接反映细胞凋亡情况。Omi/HtrA2是新型的促凋亡蛋白，当细胞处于正常的生理代谢时，其主要分布于线粒体膜间隙，当细胞收到凋亡信号时，会通过自我加工(去N端的残基)穿过线粒体膜以进入胞质，通过与其相关因子结合，激活下游的Caspase-3蛋白水平[14]。李晋娜等[15]研究显示，rhEPO可以促进Bcl-2上调、Bax下调，改善慢性缺血大鼠的神经细胞凋亡。邹礼乐等[16]研究显示，EPO可以通过抑制脑组织Omi/HtrA2表达而减少神经细胞凋亡，实现对脑损伤的保护作用。本研究结果表明，EPO可以通过调节Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白水平抑制慢性脑缺血大鼠脑组织细胞凋亡。

综上所述，EPO可以降低Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平，增加Bcl-2蛋白含量，降低大鼠MDA含量，增加SOD、CAT、GSH活性，降低大鼠脑组织细胞凋亡，增强抗氧化应激能力，从而减轻脑组织损伤。本研究只是通过大鼠模型实验来进行探讨，而在临床上是否存在相似凋亡相关蛋白水平变化，还需要进一步研究。