巴戟天不同极性萃取相的抗氧化及降血糖活性

曾铁鑫，姚志仁，李豫，朱开梅，兰圆圆，顾生玖

(桂林医学院 药学院，广西 桂林，541100)

巴戟天为龙胆目茜草科植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的干燥根茎[1], 是四大南药之一, 有补肾助阳，祛风除湿的功效, 主治阳痿、少腹冷痛、小便不禁、子宫虚冷、风寒湿痹、腰膝酸痛等[2]。而且巴戟天作为南药特色药食同源植物，具有较高的食用和药用价值，被广泛运用于各种保健食品中[3]。

抗氧化剂是能捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质[4]，可以增强机体的抗氧化能力, 是预防和治疗糖尿病及其并发症的常用物质[5]。随着生活中诱发自由基产生的辐射增多以及人类对健康越来越重视，抗氧化剂已成为食品以及医学领域研究的热点[6]，而目前常用的抗氧化剂多为西药, 有较多毒副作用，且不能有效地控制并发症[7]。中草药作为植物天然产物抗氧化剂广泛分布于自然界中，且在长期食用中没有表现出低毒性的迹象[8]，其具有多途径、多靶点、多向性且毒副作用小的药理特点，近来越来越受到人们关注[9-11]。

目前，虽然关于巴戟天抗氧化活性研究已有报道，但多为寡糖成分的研究，而对于天然抗氧化剂主要评价成分多酚类、黄酮类等较少见报道[12]。本实验通过测定巴戟天提取物不同极性萃取相总黄酮、总多酚含量，以及不同极性萃取相磷钼酸体外抗氧化活性和对DPPH自由基、羟自由基的清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶的能力[13]，以期寻找总黄酮、总多酚含量最高的萃取相以及抗氧化活性和降血糖能力最强的萃取相，为巴戟天资源在天然氧化剂和降血糖食品领域的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

巴戟天药材，由中国科学院广西植物研究所提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基，梯希爱(上海)有限公司；抗坏血酸(Vc)，天津福晨化工试剂公司；α-葡萄糖苷酶(5×106U/mL)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ，PNPG),Sigma公司；阿卡波糖,百灵威科技有限公司; 福林-酚(folin-ciocalteu),生工生物工程股份有限公司；没食子酸,成都市科龙化工试剂厂；槲皮素,天津一方科技有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

高速中药粉碎机，义海纳电器有限公司；乐祺电子天平，海瑶新电子科技有限公司；全波长Epoch酶标仪，海闪谱生物科技有限公司；EYELA旋转蒸发仪，巴玖实业有限公司。

1.3 样品制备

取巴戟天的根茎自然风干粉碎后过40目筛，称取粗粉1 000 g按料液比1∶10(g∶mL)加入体积分数95%乙醇，置于室温浸泡1周后减压抽滤，将抽滤液在旋转蒸发仪中真空浓缩，60 ℃真空干燥得巴戟天乙醇提取物。称取60 g乙醇提取物,用100 mL 60 ℃超纯水稀释，采用有机溶剂萃取法[14-15]对巴戟天乙醇提取物进行萃取，加入等体积石油醚反复萃取样品 至石油醚层无色，采用同样方法得到乙酸乙酯层、正丁醇层、氯仿层，以及萃取完剩下的水相部分。提取结束后立即进行总多酚、总黄酮含量测定以及抗氧化能力测定、自由基清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶能力测定。

1.4 实验方法

1.4.1 各萃取组分总多酚、总黄酮含量测定

(1)总多酚含量测定：参考文献[16]方法并做适当修改。绘制没食子酸标准曲线，分别取1 mg/mL氯仿相、石油醚相、醇提物相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相溶液在760 nm波长处测定其吸光度，平行实验3次，代入标准曲线计算出各极性萃取相总多酚含量。

(2)总黄酮含量测定：参考文献[17]方法并做适当修改。绘制槲皮素标准曲线，分别取1 mg/mL氯仿相、石油醚相、醇提物相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相溶液在510 nm波长处测定其吸光度，平行实验3次，代入标准曲线计算出各极性萃取相总黄酮含量。

1.4.2 钼蓝比色法抗氧化能力的测定

采用钼蓝比色法[18-19]。称取2 g磷钼酸用40 mL 95%乙醇溶解,加入1 mL 体积分数5% H2SO4溶液配制成磷钼酸溶液。将巴戟天提取物各极性萃取相分别稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的样品溶液,在96孔板内加入200 μL磷钼酸溶液，样品组加入50 μL不同浓度样品，空白对照组以50 μL 1 mg/mL的 Vc溶液替代样品溶液，样品对照组以50 μL 95%乙醇替代样品溶液，轻摇混匀。95 ℃ 孵育1 h，在705 nm处测定吸光度。样品抗氧化能力按公式(1)计算:

(1)

式中：A1,样品溶液+磷钼酸溶液吸光度；A2,样品溶液+95%乙醇吸光度；A0，Vc 溶液+磷钼酸溶液吸光度。

1.4.3 DPPH自由基清除能力的测定

参考文献[20]的方法并适当修改。取7.88 mg DPPH用40 mL无水乙醇溶解配制成500 μmol/L DPPH-乙醇溶液。将巴戟天提取物各极性萃取相分别稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的样品溶液, 并配制相同浓度的Vc溶液作为阳性对照。在96孔板内加入100 μL样品溶液后再加入100 μL浓度为500 μmol/L DPPH-乙醇溶液，混匀，室温避光反应30 min，在517 nm波长处测吸光度。根据公式(2)计算样品对DPPH自由基的清除率:

(2)

式中：A1,样品溶液+DPPH-乙醇溶液吸光度；A2,样品溶液+无水乙醇吸光度；A0,超纯水+DPPH-乙醇溶液吸光度。

1.4.4 羟自由基清除能力的测定

参考文献[21-22]的方法并做适当修改。将巴戟天提取物各极性萃取相分别稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的样品溶液, 并配制相同浓度的Vc溶液作为阳性对照。取1 mL样品溶液, 分别加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液, 再加入6 mmol/L H2O2溶液0.1 mL，37℃反应30 min, 8 000 r/min离心10 min，510 nm处测定吸光度。根据公式(3)计算样品对·OH的清除率:

(3)

式中：A1,样品提取液+FeSO4溶液+水杨酸-乙醇溶液+H2O2溶液吸光度；A2,样品提取液+FeSO4溶液+水杨酸-乙醇溶液+超纯水吸光度;A0,超纯水+FeSO4溶液+水杨酸-乙醇溶液+H2O2溶液吸光度。

1.4.5 巴戟天不同极性萃取相提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

参考文献[23-25] 方法并做适当修改。将巴戟天提取物各极性萃取相分别稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的样品溶液,取150 μL不同质量浓度巴戟天各极性萃取相提取物加入96孔板内，再分别加入10 μL pH 7.4磷酸盐缓冲溶液和10 μL 1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，充分混匀后放置于37 ℃ 孵育10 min，再加入50 μL 10 mmol/L的PNPG溶液，孵育30 min后，加入50 μL 1 mol/L 的NaOH溶液终止反应。分别设置空白组、对照组、样品组。按照表1加样进行实验，在410 nm波长处测定吸光度。

表1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的实验加样表

单位：μL

根据公式(4)计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率:

(4)

式中：A1,样品组吸光度；A2,空白组吸光度；A0,对照组吸光度。

1.5 统计学处理方法

实验结果采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计算结果以平均数±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.0进行数据处理并得出各极性萃取相相应的抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制率。

2 结果与分析

2.1 巴戟天各极性萃取相总多酚、总黄酮的含量

以没食子酸标准溶液质量浓度为X轴, 对应吸光度为Y轴, 得到其标准曲线为y=7.881 7x-0.006 5，R2=0.993 7，质量浓度在0～0.02 mg/mL标准曲线呈良好线性关系。以槲皮素标准溶液质量浓度为X轴, 溶液吸光度为Y轴, 得到标准曲线为y=3.732 1x+0.001 5，R2=0.994 8，质量浓度在0～0.01 mg/mL标准曲线呈良好线性关系。由没食子酸标准曲线计算得出巴戟天各极性萃取相总多酚含量，其中氯仿相多酚含量最高为(514.97±2.9)mg/g，各极性萃取相中总多酚含量依次为氯仿相>醇提物相>石油醚相>正丁醇相>水层相>乙酸乙酯相。由槲皮素标准曲线计算得出巴戟天各极性萃取相总黄酮含量，氯仿相黄酮含量最高为(46.3±1.21)mg/g，各极性萃取相中总黄酮含量依次为氯仿相>石油醚相>醇提物相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水层相。

表2 巴戟天醇提物各极性萃取相中的总多酚和总黄酮含量 单位：mg/g

2.2 抗氧化能力测定

2.2.1 钼蓝比色法测定抗氧化能力

以Vc为对照对巴戟天提取物各萃取相进行抗氧化活性检测，由图1可知,各极性萃取相均有一定的抗氧化活性，在质量浓度为1 mg/mL时,氯仿相抗氧化能力最强为73.9%，高于同浓度巴戟天其他极性萃取相。巴戟天各极性萃取相抗氧化能力大小为氯仿相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相>水层相>醇提物相。

图1 巴戟天各极性萃取相抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of polar phases of M.officinalis How with different polarity

2.2.2 对·OH的清除能力

如图2所示,在实验浓度范围内巴戟天各极性萃取相均有一定的清除羟自由基活性,当浓度为1 mg/mL时,氯仿相清除·OH的活性最强,对·OH清除率为59.6%。巴戟天各极性萃取相对·OH清除率大小依次为氯仿相>石油醚相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水层相>醇提物相。氯仿相各浓度对·OH的清除率均高于同浓度下其他各极性萃取相。可以证明巴戟天清除·OH活性成分主要集中在氯仿相。

图2 巴戟天各极性萃取相对·OH清除率Fig.2 Relative hydroxyl radical scavenging rate of M.officinalis How with different polarity

2.2.3 对DPPH自由基的清除能力

如图3所示,随着浓度升高巴戟天各极性萃取相对DPPH自由基显示出不同程度的清除活性，且氯仿相最高，当质量浓度为1 mg/mL时，氯仿相对DPPH自由基清除率为68.0%。巴戟天氯仿相清除率远高于同浓度下其他相对DPPH自由基清除率。由此证明，巴戟天清除DPPH自由基活性成分主要集中在氯仿相。

图3 巴戟天不同极性萃取相对DPPH自由基清除率Fig.3 Relative DPPH radical scavenging rate of M.officinalis How with different polarity

2.3 对α-葡萄糖苷酶抑制作用

由图4可知,巴戟天不同极性萃取相均对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,且在一定浓度范围内呈线性变化，氯仿相抑制效果最为明显且强于阳性对照阿卡波糖。巴戟天各相对α-葡萄糖苷酶的抑制力强弱为氯仿相>阿卡波糖>石油醚相>醇提物相>乙酸乙酯相>正丁醇相>水层相。而氯仿相在浓度1 mg/mL时抑制率为97.9%，其各浓度抑制率都高于其他相，可以证明巴戟天中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分主要集中在氯仿相。

图4 巴戟天不同极性萃取相对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.4 Relative α-glucosidase inhibition rates of M.officinalis How with different polarity

3 结 论

本实验测定了巴戟天各极性萃取相的总多酚、总黄酮含量，以及测定了各极性萃取相体外抗氧化、降血糖能力。结果表明,巴戟天总多酚含量最高的为氯仿相(514.97±2.9)mg/g，总黄酮含量最高的也为氯仿相(46.3±1.21)mg/g。巴戟天各极性萃取相均有一定的体外抗氧化能力及抑制α-葡萄糖苷酶能力，并在一定浓度范围内与样品浓度呈线性相关。在质量浓度1 mg/mL时氯仿相磷钼酸抗氧化能力达到73.9%，对DPPH自由基清除率为68.0%，对·OH清除率为59.6%，均高于其他相；虽弱于公认的天然抗氧化剂Vc,但也有很强的抗氧化能力。对α-葡萄糖苷酶抑制力最强的也是氯仿相，且氯仿相抑制力强于同浓度阳性对照阿卡波糖，抑制活性极好。可以得出巴戟天体外抗氧化、降血糖主要活性成分集中在氯仿相。结果表明，巴戟天提取物氯仿相总多酚、总黄酮含量均高于其他相，且体外抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性也高于其他相，是巴戟天提取物的主要活性部位。在抑制α-葡萄糖苷酶活性实验中，氯仿相的活性强于阳性对照阿卡波糖，在1 mg/mL时达到97.9%。在巴戟天各极性萃取相中总多酚含量远远大于总黄酮含量，可以初步推测其主要活性成分为多酚类物质。本文为巴戟天在天然氧化剂和降血糖食品方面的开发利用提供参考依据。