一株产酸性菊粉酶乳酸菌的筛选及其酶学性质研究

黄澄，陈睿，朱春燕，卢良华，王成华

(广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁，530000)

菊粉是由D-呋喃果糖通过β-2,1-糖苷键缩合形成的线性链状多糖，且末端以α-1，2-糖苷键连接一个葡萄糖残基，通常包含2～60个果糖单元[1-2]。作为一种常见的植物贮藏性多糖，菊粉存在于全世界超过36 000种植物组织中[3]。其中，菊芋块茎含有大量的菊粉，约占其块茎干重的70%[4]，其种植简单、适应性强[5]，成为目前生产菊粉的最常用植物。菊粉作为可再生非粮生物质资源，在生产高果糖浆、生物乙醇、低聚果糖等食品、生物化工领域具有广阔的市场[6]。

菊粉酶，学名β-2,1-D-果聚糖酶，一种能够水解β-2,1-D-果聚糖糖苷键的水解酶，是开发利用菊粉等果糖基可再生资源的关键酶类。根据菊粉酶作用方式的不同，可将菊粉酶分为2类，外切型菊粉酶和内切型菊粉酶。内切菊粉酶可随机水解菊粉链内部的糖苷键，生成物主要为低聚果糖；外切菊粉酶则逐一水解菊粉链的非还原性末端的糖苷键，主要产物为果糖和少量葡萄糖，可被用于菊粉高果糖浆的生产等[7-8]。目前报道的大多数菊粉酶最适pH范围在4.5～6.5[9-10]，而酸性条件(pH<4.5)更利于维持果糖的稳定性、抑制微生物污染以及有效抑制副产物和色素的产生。因此，大力开发高效酸性菊粉酶，对于改进已有酶法工艺、提高生产效率等具有重要的应用前景和商业潜力。国内外已开展了马克斯克鲁维酵母等来源菌株菊粉酶的筛选，同时开展了毕赤酵母等基因工程菌生产重组菊粉酶的研究，但鲜见报道来源于食品级微生物的酸性菊粉酶。PALUDAN-MÜLLER等[11]报道了1株产弱酸性菊粉酶的Lactobacilluspentosus，这也是目前报道的唯一一个乳酸菌来源的食源酸性菊粉酶，这为筛选新型酸性乳酸菌菊粉酶提供了思路。本研究从课题组前期构建的来源于广西特色生榨米粉的乳酸菌库中筛选出产酸性菊粉酶的乳酸菌，对其分类鉴定，并进行及酶学性质的研究和水解产物的检测，为酸性菊粉酶的开发应用提供了新的选择。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

广西特色生榨米粉来源乳酸菌，本实验室保藏；菊粉(90%)，上海源叶生物公司；酵母提取物,OXOID 公司；蛋白胨、牛肉膏，Solarbio公司；K2HPO4、MgSO4、MnSO4、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温-80、3,5-二硝基水杨酸，成都金山化学试剂有限公司；(NH4)2SO4、NaOH、醋酸、正丁醇、磷酸、异丙醇、二苯胺、丙酮、苯胺、结晶酚，成都市科龙化工试剂厂；微量点样毛细管、硅胶层析板(20 cm×20 cm)，青岛海洋化工厂；菊糖、果糖、蔗糖、葡萄糖标准品，Sigma公司；琼脂糖，OMEGA 公司;细菌基因组DNA试剂盒、DNA纯化试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司。

DNS试剂：称取5.3 g 3,5-二硝基水杨酸、9.9 g NaOH于708 mL水中，充分溶解后加入153 g酒石酸钾钠，再加入4.15 g Na2SO3和 3.8 mL 45 ℃水浴溶解的结晶酚，不断搅拌直至完全溶解后，定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中，于室温避光放置7 d。

培养基：20 g菊粉、10 g牛肉粉、5 g酵母提取物、10 g蛋白胨、2.0 g柠檬酸二铵、5.0 g乙酸钠、2 g K2HPO4、0.58 g MgSO4、0.25 g MnSO4、1 mL吐温-80，1 000 mL蒸馏水，pH 6.6～6.8，配制固体培养基时，加入琼脂20 g，121 ℃高压灭菌 15 min。

薄层层析(thin-layer chromatography，TLC)试剂：展开剂为正丁醇、异丙醇、醋酸、水按7∶5∶1∶2(体积比)混合，显色剂为体积分数2%二苯胺-丙酮溶液、体积分数2%苯胺-丙酮溶液、体积分数85%磷酸按5∶5∶1(体积比)混合。

1.2 仪器设备

SW-SJ-2F超净工作台，苏净安泰公司；5401D006843 低温高速离心机，Eppendorf公司；TOMY Autoclave 高压灭菌锅，TOMY公司；DYY-8C 电泳仪，北京六一生物科技有限公司；MJ-Ⅱ 电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；Infinite M200 PRO 酶标仪，TECAN公司；ChemiDoc MP 全能型凝胶成像分析仪、T100 梯度PCR仪，Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 产菊粉酶菌株筛选

初筛：将本课题组前期从广西壮族传统生榨米粉中筛选出的乳酸菌划线至固体培养基中(菊粉为唯一碳源)，于30 ℃静置培养直至出现单菌落，将正常生长的单菌落接种至液体发酵培养基中，于30 ℃静置发酵1～2 d。

复筛：取出15 mL初筛所制备的发酵液在4 ℃条件下，10 000 r/min离心2 min，弃上清液，用600 μL醋酸缓冲溶液(0.2 mol/L、pH 5.0)重悬沉淀，后加入溶菌酶进行破胞，破胞结束后，按上述相同条件离心40 min，检测上清液中的菊粉酶酶活力，选出其中酶活力最高的菌株 1-1进行后续试验。

1.3.2 酶活力测定

酶活力测定中所用底物质量浓度均为5 g/L，菊粉溶液和蔗糖溶液均用醋酸缓冲液(0.2 mol/L、pH 5.0)配制而成。

参照PESSONI等[12]的方法对菊粉酶进行酶活力测定。取100 μL酸性菊粉酶分别加入200 μL 5 g/L菊粉溶液和200 μL 5 g/L蔗糖溶液，在30 ℃水浴中放置30 min后立即100 ℃灭活5 min，冷却后加入300 μL DNS，置于100 ℃水浴中7 min进行显色，迅速冷却后在540 nm波长处测定吸光值，参照葡萄糖标准曲线来计算还原糖含量，以灭活的酶液作为空白对照。设3次重复试验，取平均值。

酶活力定义[13]：在30 ℃、pH 5.0的条件下，每1 min产生1 μmol还原糖所需的酶量，即为1个酶活力单位(U)。其中1个菊粉酶活力(I)单位定义为每1 min催化菊粉转化为1 μmol果糖所需的酶量，1个转化酶活力(S)单位定义为每1 min催化蔗糖转化为1 μmol果糖所需的酶量。

(1)

式中：E，样品酶活力，U/mL；c，标准曲线上对应的葡萄糖浓度，μmol/mL；V1，反应液总体积，mL；n，粗酶液稀释倍数；T，反应时间，min；V2，反应液中粗酶体积，mL。

1.3.3 菌株鉴定

通过菌落观察和基因序列分析对菌株进行鉴定。使用细菌基因组DNA试剂盒，按照说明书提取菌株基因组DNA，使用超微量全波长分光光度计对提取的基因DNA样液进行定量，将其稀释至1 ng/μL，并以此作为PCR扩增的模板。使用细菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30次循环，72 ℃终延伸2 min。取5 μL PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证，将验证后的PCR产物通过DNA纯化试剂盒进行纯化，再由六合华大基因科技有限公司进行测序，测序结果输入基因数据库(GenBank)进行同源性分析。

1.3.4 酶学性质研究

1.3.4.1 温度对粗酶液酶活力和稳定性的影响

参照1.3.2的酶活力测定，将菊粉酶分别在20～80 ℃进行反应，每5 ℃为1个温度梯度，测定酶活力，以测定结果最高酶活力为100%，计算各测定组的相对酶活力；将菊粉酶分别在20～80 ℃保温30 min，冷却后测定酶活力，以未经处理酶的酶活力为100%，计算各组的相对酶活力。

1.3.4.2 pH对粗酶液活力和稳定性的影响

参照1.3.2的酶活力测定，配制不同pH的缓冲液，pH 3.5～5.0为醋酸缓冲液，pH 5.5～7.5为磷酸缓冲液，pH 8.0～9为Tris-HCl缓冲液，pH 9.5～11.0为碳酸缓冲液。将菊粉酶与上述不同pH缓冲液配制的菊粉溶液进行反应，测定酶活力，以最高结果为100%，计算各测定组的相对酶活力；用不同pH的缓冲液稀释菊粉酶液，于4 ℃放置1 h，测定酶活力，以未经处理酶的酶活力为100%，计算各组的相对酶活力。

1.3.5 TLC分析水解产物

以菊粉为底物，将200 μL菊粉酶与100 μL底物在最适温度、最适pH条件下水解10 h，得到水解产物。TLC方法参照文献报道[14]。用去离子水将各标准品配制成质量浓度为2.0 mg/mL的标准品试剂，用微量点样毛细管依次对标准品试剂和水解产物进行点样，点样量5 μL。展开完成后喷雾显色剂，待自然风干后置于105 ℃加热5 min，即可进行观察。

2 结果与分析

2.1 产菊粉酶菌株筛选

在本课题组的广西特色生榨米粉来源乳酸菌库中，筛选出1株可以正常生长在以菊粉为唯一碳源的培养基上，且具有相对较高酶活力的菌株1-1，后续试验均选用此菌株。以菊粉为底物，在30 ℃，pH 5.0条件下进行3组平行试验，取平均值，测得菌株1-1的菊粉酶活力I=(0.23±0.03) U/mL；以蔗糖为底物，在30 ℃，pH 5.0条件下进行3组平行试验，取平均值，测得菌株1-1的转化酶活力S=(0.92±0.06) U/mL，两者的比值(I/S)为0.25，I/S<1表明该酶为外切菊粉酶[15]，其菊粉酶活力略低于王翠[7]报道放线菌F01的菊粉酶活力(0.37 U/mL)。

2.2 菌株鉴定

菌株1-1菌落形态如图1所示，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色或暗黄色。以基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA序列。PCR产物凝胶电泳结果如图2所示，扩增条带在1 500 bp左右，与预期相符。

M-marker; 1-菌株图1 菌株1-1平板培养菌落形态Fig.1 Colony morphology of 1-1

M-marker;1-菌株图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR

16S rDNA基因序列与GenBank中进行序列比对，发现其与柠檬明串珠菌Leuconostoccitreumstrain CBA3623相似率达99.59%，可初步鉴定该菌株为柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum，将其命名为Leuconostoccitreum1-1，并将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019971。

2.3 酶学性质研究

2.3.1 温度对菊粉酶酶活力和稳定性的影响

以菊粉为底物，对菌株1-1所产菊粉酶的最适反应温度和温度稳定性进行测定，结果如图3所示。

a-温度对酶活力的影响; b-温度对稳定性的影响图3 温度对酶活力和稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on activity and stability of the inulinase

由图3-a可知，该酶的最适反应温度为35 ℃，比PALUDAN-MULLER人[11]报道的Lactobacilluspentosus所产菊粉酶最适温度高10 ℃。由图3-b可知，该酶在热处理30 min条件下，20～45 ℃保持60%以上的最大酶活力。以上结果表明筛选的菊粉酶具有相对较高的最适反应温度和较宽的温度耐受范围，在工业生产中具有一定的开发潜力。

2.3.2 pH对菊粉酶活力和稳定性的影响

菌株1-1菊粉酶的最适反应pH和pH稳定性测定结果如图4所示。由图4-a可知，该酶的最适反应pH为4.0，低于目前已报道的菊粉酶，如于春等[16]报道的灰平链霉菌StreptomycesgriseoplanusS501的最适pH(5.0)和高威[17]报道的BacillussmithiiT4的最适pH(4.5)。如图4-b所示，该酶在pH 3.5～10.0较宽泛范围内，保持65%以上的酶活力。该酸性菊粉酶有着较强的耐酸特性和较宽的pH耐受范围，有利于菊粉的水解以及抑制副产物的产生。

a-pH对酶活力的影响; b-pH对稳定性的影响图4 pH对酶活力和稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on activity and stability of the inulinase

2.3.3 TLC分析水解产物

采用TLC对L.citreum1-1菊粉酶水解菊粉的产物进行分析，结果如图5所示。

1-菊糖；2-果糖；3-葡萄糖；4-蔗糖；5-水解产物图5 菊粉酶水解产物TLC分析Fig.5 TLC for characterization of inulin hydrolysis products by inulinase

从图5可知，在菊粉酶与菊粉反应后，菊粉得到了明显的降解，降解产物中几乎100%为单糖，产生大量果糖以及少量葡萄糖，无蔗糖成分，这与L.citreum1-1菊粉酶为外切菊粉酶从非还原末端逐一降解糖苷键生成果糖和少量葡萄糖的作用方式相一致，同时与根据I/S值的鉴定结果一致。因此，L.citreum1-1菊粉酶具有应用于高果糖浆生产的潜力。

3 结论

研究首次从广西壮族传统生榨米粉中筛选出1株产酸性外切菊粉酶的柠檬明串珠菌L.citreum1-1。该菌株所产菊粉酶的酶活力为0.23 U/mL，转化酶活为0.92 U/mL，最适反应温度为35 ℃，最适反应pH为4.0，在20～45 ℃和pH 3.5～10.0的较宽范围内保持稳定，水解产物为大量果糖和少量葡萄糖。

研究目前对L.citreum1-1只进行了初步研究，未对发酵条件进行优化，可能是其酶活力较低的原因，但是该酶具有更低的最适反应pH和较强的耐酸性，更有利于大规模生产，且该酶来源于传统食品来源的柠檬明串珠菌，作为一种食源性乳酸菌酸性菊粉酶，其安全性在食品行业具有广阔的发展前景和商业价值。今后的研究将致力于菌株产酶发酵条件的优化，以及基因重组的手段实现菊粉酶的高效表达和酶学性质表征，为工业发酵生产菊粉酶制剂以及高果糖浆的开发利用打下基础。