奶牛乳房炎多联苗的研制及应用试验

李心海，罗 珠，张林吉，迟 兰

（徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221151）

奶牛乳房炎是由多种非特定的病原微生物引起的乳腺组织炎症。其病原包括细菌、真菌、霉形体和病毒等，有150多种[1]。引起奶牛乳房炎主要致病菌包括球菌、杆菌、支原体、病毒等，其中以链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和霉形体为主，占奶牛乳房炎致病菌的90%以上。奶牛乳房炎轻者使奶牛产乳量下降，乳变质，重者引起乳房化脓、坏疽、萎缩而失去泌乳能力，严重影响奶牛的生产性能。而且乳房炎病牛乳汁中的大量病原微生物及其产生的毒素严重影响牛奶的品质，部分细菌产生的耐热毒素经过常规乳制品生产工艺过程也不会被破坏(如葡萄球菌耐热毒素)，从而成为危及人健康的潜在危害[2]。长期以来，一直使用抗生素来防控奶牛乳房炎的发生，但抗生素易产生耐药性，并且在奶制品中易残留。为了有效防控奶牛乳房炎的发生，进行了奶牛乳房炎多联苗的研制及应用试验研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培养基与试剂 佐剂与培养基主要包括普通营养琼脂、氢氧化铝胶为佐剂、普通营养肉汤、鲜血琼脂、麦康凯琼脂、甘露醇高盐琼脂、伊红美蓝琼脂等。糖生化发酵管有葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等。试剂主要有MR试剂、吲哚试剂、V-P试剂、马尿酸盐、枸橼酸盐、尿素酶、七叶苷等。

1.1.2 主要仪器 生化培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平、离心机、显微镜、酶联免疫检测仪等。

1.1.3 试验动物 奶牛：来自徐州市郊 A、B 两个奶牛场，所选奶牛按照各场围产期奶牛正常饲养条件饲养。小白鼠：体重18～20 g，购自徐州医学院。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养、鉴定试验 从徐州市郊A、B 两个奶牛场，采奶样166份。采前先用温水清洗乳房，擦干后再用2g/L的新洁尔灭和酒精棉对奶牛乳房、乳头和采样人员的手指进行消毒，待干后，弃去前3把奶，每头病例采奶样5～10ml于灭菌瓶中，加盖封紧，标明牛号和日期，随即置于附有冰袋的采样箱内，-20℃冷冻保存。按文献[3,4]所述方法进行病原菌分离培养和鉴定。

1.2.2 病原菌毒力测定 37℃培养16h的细菌培养液，以无菌生理盐水稀释成含菌10.0×108/ml、8.0×108/ml、4×108/ml及2×108/ml等浓度的细菌液。用每一稀释度菌液，腹腔注射5只体重为20g左右的小白鼠，0.5ml/只，观察3d。使小白鼠于感染后3d内全部死亡的最小剂量为该细菌的1个最小致死量(MLD)。

1.2.3 多联灭活疫苗抗原的培养 （1）无乳链球菌、停乳链球菌抗原的培养。将种子液接种于改良牛肉汤中，置37℃摇床培养18h，将培养好的菌液进行离心浓缩、涂片纯检。（2）金黄色葡萄球菌的培养。用吸管将种子液接种到70ml/L羊血琼脂扁瓶中，将扁瓶置于37℃培养18h。培养好后用生理盐水将菌苔洗下，保存备用，取样涂片纯检。（3）大肠杆菌的培养。将种子液接种于普通营养肉汤中，置37℃培养18h，将培养好的菌液进行离心浓缩、涂片纯检。（4）菌量测定培养菌液用麦氏比浊法测定其含菌量。

1.2.4 灭活培养菌液 将各培养的菌液加入0.4%甲醛，37℃、灭活36h。

1.2.5 灭活疫苗的配制 将检验合格的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌抗原按细菌含量以3:2:1.5的比例混合，即每毫升疫苗含葡萄球菌3×108、链球菌2×108、大肠杆菌1.5×108。然后加入20%氢氧化铝胶，再加入万分之一硫柳汞进行防腐，充分混匀即得到疫苗。密封疫苗瓶口，贴标签，置于4～15℃冷暗处保存。

1.2.6 疫苗检验 （1）无菌检验：制备的多价灭活疫苗，无菌接种到普通牛肉汤、血琼脂斜面、厌氧肉肝汤上37℃培养48～72h，观察是否有细菌菌落生长。（2）安全检验：选取体重20g左右的小白鼠5只，皮下注射多联菌苗0.2ml，连续观察7d。（3）攻毒保护试验：多联菌苗皮下注射0.2ml于20g左右小白鼠20只，免疫后20d后进行毒菌攻毒。小白鼠腹腔注射最小致死量的毒菌，观察小白鼠的健康状况。

1.2.7 多联疫苗最佳免疫剂量 疫苗分别给3组泌乳牛后海穴注射2、4、6ml[5]，同时设未注射疫苗牛为对照组，每组30头泌乳牛，于注射后第20d统计各试验组及对照组乳房炎的发病率，统计3个月。

1.2.8 田间试验 将选择徐州市A、B两牛场加强免疫后的牛和同期产奶的未免疫牛为田间试验观察比较对象，进行3个月的跟踪监测，统计临床、隐性乳房炎发病情况、免疫后第2个月时7d内的平均产奶量。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离、鉴定

采样166份奶样中，86份为乳房炎样本，根据细菌的分离培养和生化鉴定结果进行分析，分离出七种细菌共79株，金黄色葡萄球菌24株，占30.4%；无乳链球菌9株，占11.4%；表皮葡萄球菌14株，占17.7%；停乳链球菌13株，占16.5%；大肠埃希氏菌9株，占11.4%；乳房链球菌7株，占8.9%；克雷伯氏菌3株，占3.8%。

2.2 病原菌毒力测定

葡萄球菌MLD为3.0×108/ml；链球菌MLD为2.0×108/ml；大肠杆菌MLD为1.5×108/ml。

2.3 多联灭活疫苗抗原的培养

将培养好的菌液进行离心浓缩、涂片纯检，均无杂菌。

2.4 无菌检验

各培养基上均无细菌菌落生长，判定疫苗无菌。

2.5 安全检验

结果见表1。

表1 疫苗安全检验结果

2.6 攻毒保护试验

观察7d，小白鼠无异常反应。疫苗判为合格。

2.7 最佳免疫剂量

表2 多联疫苗最佳免疫剂量 (%)

2.8 田间试验

表3 试验前后隐性乳房炎发病情况(头、个、%)

表4 试验前后临床型乳房炎发病情况 (头、个、%)

表5 奶牛场试验前后奶产量变化(头、kg、%)

3 讨论

（1）将检验合格的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌抗原按细菌含量以3:2:1.5的比例混合，即每毫升疫苗含葡萄球菌3×108、链球菌2×108、大肠杆菌1.5×108。将上述成分制成多联疫苗。（2）通过无菌检验、安全试验、攻毒保护试验证实所研制的多联菌苗是一种安全、无毒、疫苗，多联疫苗最佳免疫剂量试验表明：奶牛注射6ml剂量可产生较好效果。进行了田间试验，证实试验前隐性乳房炎发病率为46.9%，试验后隐性乳房炎发病率为16.4%，降低发病率65.2%；试验前临床型乳房炎发病率为16.6%，试验后临床型乳房炎发病率为6.3%，降低发病率62.4%；奶牛场试验前每头牛单产5480kg，试验后每头牛单产6085kg，每头牛增加奶产量605kg，增产率为11%。试验表明：从奶牛场分离出的奶牛乳房炎病原菌制成的多联苗可以有效地预防奶牛乳房炎的发生，并且，可使奶牛的产量增加。