高效液相色谱-串联质谱法测定鸡可食性组织中红霉素残留量研究

杨修镇，尹伶灵，李有志，惠庆亮，牛华星，陈志强，陈 玲

（山东省兽药质量检验所/山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，山东 济南 250022）

红霉素是由红霉素链霉菌产生的一种大环内酯类抗生素，属于广谱抗生素，具有抗革兰氏阳性菌活性、抗支原体活性，用于治疗呼吸性及传染性疾病[1]。研究表明[2-5]，食品中的红霉素残留不仅易造成致敏和毒性反应，致使细菌耐药性升高，引起携带耐药因子菌株的扩散，残留的药物进入环境中还会导致严重的环境问题。中国[6]、美国[7]、欧盟委员会[8]、日本[9]等均对鸡可食性组织(肌肉、肝脏、肾脏、皮脂)中红霉素的最大残留量(MRL)进行了规定。

目前测定动物源性食品中红霉素残留量的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气质联用法、微生物检测法、酶联免疫分析法、胶体金免疫层析法、荧光微球免疫层析法等[10]。我国现有红霉素残留量检测方法样品基质多是畜禽肉、水产品和环境样本，针对鸡肝、鸡肾、鸡脂肪中红霉素残留的检测方法罕有报道。液相色谱-串联质谱法将色谱的分离能力与质谱的定性能力结合起来，适用于复杂痕量组分的分析，具有高灵敏度和特异性[11]，因此选用液相色谱-串联质谱法进行研究，成功建立了鸡可食性组织中(肌肉、肝脏、肾脏、皮脂)中红霉素残留量的检测液相色谱串联质谱法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相-串联质谱仪(Waters Xevo TQ-S)：配有电喷雾离子源(ESI)；电子天平(感量0.01g、0.00001g)；高速分散均质机(FJ-200)；多管涡旋振荡器(VX-III)；离心机(CF16RXⅡ，转速10000 r/min)；氮吹仪(N-EVAP-112)；有机滤膜(0.22µm)；固相萃取仪装置及HLB固相萃取柱(Waters公司)；红霉素(Erythrom ycin，CASNO.114-07-8)，纯度大于99.0%；红霉素-D3(Erythro mycin-13C，D3，CASNO.114-07-8959119-26-7)；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液配制

精密称取红霉素及其内标10mg，分置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度各为100µg/ml的标准贮备液。分别精密量取红霉素及其内标贮备液各100µl，分置10ml容量瓶中，用乙腈-0.1%甲酸水溶液(3:7，v/v)稀释至刻度，配制成浓度各为1µg/ml的标准工作液。

1.3 前处理条件

1.3.1 提取 依据参考文献[12]方法，称取匀浆后的样品2g(精确至0.01g)置50ml离心管中，加入1µg/ml红霉素内标标准工作液50µl，再加入5.0g氯化钠，15ml乙腈振荡提取15min，于10000r/min离心10min，将上清液转入另一50ml离心管，残渣中加乙腈10ml，重复提取一次，合并两次上清液45℃水浴用氮气吹干，加入磷酸盐缓冲溶液(pH6.8)10ml，溶解残余物，加正己烷10ml，混合1min，10000r/min离心5min，取下层溶液备用。

1.3.2 净化 HLB固相萃取柱，依次用甲醇5ml，水5ml和磷酸盐缓冲液(pH6.8)5ml活化。取下层溶液过HLB柱，分别用磷酸盐缓冲液(pH6.8)5ml，水5ml和甲醇溶液(4:6，v/v)5ml淋洗，抽干，用甲醇5ml 洗脱，收集洗脱液于45℃氮气吹干，加入1ml乙腈-0.1%甲酸水溶液(3:7，v/v)涡旋1min，过0.2µm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：BEHC18(50×2.1mm，1.7µm)；流动相：A相为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为0.1%甲酸水溶液；流速：0.25ml/min；进样量：2µl。柱温：40℃；洗脱条件如表1。

表1 流动相梯度洗脱条件 (min、ml·min-1、%)

1.4.2 质谱条件 电离模式：电喷雾正离子(ESI+)，毛细管电压：3.0kv，离子源温度：150℃，脱溶剂温度：450℃，脱溶剂气流速：550L/Hr，锥孔反吹气流速：50L/Hr；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮，采集方式：多反应监测(MRM)，红霉素及其内标的定性、定量离子见表2。

表2 红霉素及其内标特征离子参考质谱条件

2 结果与分析

2.1 方法的专属性

选择20批各组织空白样品按照1.3项方法处理后，在规定的测试条件下进行检测，未发现有假阳性结果，表明该方法的专属性良好。

图1 空白组织色谱图

图2 空白组织阳性添加色谱图

2.2 基质效应试验

称取各组织空白样品2g(精确至0.01g)，平行六份，按照1.3项方法处理至“收集洗脱液于45℃氮气吹干”。精密吸取浓度为1 µg/ml的标准溶液1ml，置10ml容量瓶中，用乙腈-0.1%甲酸水溶液(3:7，v/v)稀释至刻度，配制成浓度为100ng/ml的溶液，分别精密吸取1ml置空白样品吹干的基质中，涡旋1min，过0.2µm滤膜，在规定的测试条件下进行检测，所得面积均值和RSD如表3所示。结果表明，各组织基质标准品溶液与溶剂标准品溶液相比有明显的基质抑制作用，且各组织基质抑制作用存在明显差异，因此，后续试验均采用内标法进行定量校正。

表3 基质标准品效应试验 (ng·ml-1、%)

2.3 线性范围

精密吸取1µg/ml的 标准工作液，用乙腈-0.1%甲酸水溶液(3:7，v/v)配制成红霉素浓度为1、2、10、50、100、500ng/ml红霉素内标浓度均为50ng/ml的系列标准溶液，在规定的测试条件下进行检测，以标准溶液中红霉素定量峰面积和红霉素内标定量峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中相应红霉素浓度与红霉素内标的浓度比值为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y=1.0624x-0.08，曲线的R2为0.9993。结果表明，红霉素进样浓度在1～500ng/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 方法的灵敏度[13]

在各空白组织中添加红霉素标准溶液，按1.3项方法处理后，在规定的测试条件下进行检测，计算信噪比。满足欧盟657号决议规定的定性条件的最低添加量为本方法的检出限，大于检出限，定量离子色谱峰的信噪比(S/N)满足在10:1以上且回收率满足70%～120%之间的最低添加量为本方法的定量限。本方法的检出限为0.5µg/kg，定量限为1.0µg/kg。

2.5 方法的准确度和精密度

取各空白组织，每种组织3批，每批中添加红 霉 素 1.0µg/kg(LQD)、 50µg/kg(1/2MRL)、200µg/kg(2MRL) 3个不同浓度，每个浓度平行6份，按1.3项方法处理后，在规定的测试条件下进行检测，计算回收率，回收率在70%～120%之间，相对标准偏差均小于10%，结果见表4。

表4 鸡可食性组织中红霉素添加回收率试验结果

2.6 样品实测测结果

从农贸市场随机购买鸡可食性组织各50批，按照本研究建立的方法进行检测，结果有10批检出红霉素残留，但均未超出最大残留限量。

3 讨论与小结

红霉素易溶于乙醇、乙腈、甲醇等有机溶剂，鸡可食性组织中的干扰物主要为蛋白和脂肪，乙腈可以很好的沉淀蛋白故选用作为提取溶剂；为除去基质中的脂肪，采用正己烷液液萃取除脂。为达到分离和富集目标化合物提高检测灵敏度的目的，采用HLB固相萃取柱进行净化，与文献[12,14]方法相比检出限提高10倍和定量限提高20倍。与文献[12]方法比较，本方法在液相色谱条件也有大大改进，正离子模式下甲酸能够促进目标化合物电离，故选用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，效果大大优于文献中的乙腈-0.5%氨水(92:8)系统。

本文建立的鸡可食性组织中红霉素残留检测方法，前处理简便；串联质谱法检测定性准确；同位素内标法定量准确度高、重复性好；检出限为0.5µg/kg，定量限为1.0µg/kg灵敏度高，适用于鸡可食性组织中红霉素残留量的检测，可以满足对食品安全隐患排查需求。