低氧预适应小鼠对免疫器官及非特异免疫细胞的调节作用

许文胜，崔丽霞，刘雄伟，刘明吉，闫 娇，张 涛

(1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院图书馆；3.内蒙古科技大学包头医学院研究生学院2018级研究生；4.内蒙古科技大学包头医学院学生处；5.内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院)

早期人类对低氧的研究并不多，人们发现缺氧导致呼吸困难，主要集中在暴露于低氧大气中的高原土著人，除了成功地适应大气低氧外，他们的体内平衡能力没有增加[1]。霍尔丹经研究认为与所谓的物理化学的大脑有关，组织细胞对缺氧的获得性耐受被认为是通过进化发展起来的[2]。随后，随着缺氧动物模型建模成功，从行为学、神经生理学、神经化学、神经形态学和分子生物学的角度探讨缺氧。公认为缺血、低氧(Ischemia/Hypoxia Preconditioning,I/HPC)预适应指机体预先受一次或多次短暂、非致死性缺血/低氧刺激,再恢复常态后,从而获得对更严重甚至致死性缺血或缺氧有更强的抵抗能力，是临床常见的基本病理过程和死因[3-4]。HPC能导致细胞基因表达和炎症因子分泌的改变，从而参与炎症反应。这是低氧导致炎症反应和组织损伤的原因之一，也是肿瘤炎症微环境的重要因素，导致机体免疫系统紊乱,诱发一系列问题而出现炎症、损伤、甚至死亡[5-6]。低氧在免疫系统中的作用到目前为止尚不清楚,中枢神经系统曾被定义为组织学上的免疫豁免区，但越来越多的证据表明,居留于中枢神经系统的细胞也可分泌各种炎症介质并表达其受体,启动免疫过程，近年来的研究表明,多种免疫细胞及细胞因子参与了脑损伤的发生发展及修复过程[7]。非特异性免疫是人体的第一道防线，吞噬细胞是非特异免疫中的重要组成部分，本文主要对吞噬细胞基本功能进行初步的研究。

1 对象与方法

1.1对象与试剂 6～8周雄性昆明小鼠,体重18～22 g。药品与试剂主要有：75 %乙醇、1640培养液、胎牛血清、PBS缓冲液ConA、小鼠IL-2试剂盒(南京金益柏生物科技有限公司)。培养皿,光学显微镜,无菌纸,广口瓶,镊子,眼科剪,橡皮塞,注射器,Ep管,50目钢网,细胞计数板,50 mL离心管，离心机,孔板,光学显微镜,电子秤。

1.2方法

1.2.1实验动物分组 60只小鼠随机分为3组，每组20只。对照组小鼠不进行低氧暴露(H0)、实验组低氧暴露1次(H1)和低氧暴露4次(H4)，暴露结束后立即进行后续实验。

1.2.2小鼠低氧预适应模型 低氧预适应模型制备是将小鼠置于125 mL广口瓶内，用橡皮塞密闭，观察小鼠情况，如出现喘息式呼吸，立即取出，转移到另一相同体积含有新鲜空气的广口瓶内记录，同时记录低氧耐受时间，即为低氧暴露1次组(H1)。继续进行动物密闭，观察、记录低氧耐受时间，依次类推进行4次，即为低氧暴露4次组(H4)。对照组不进行缺氧暴露，为非低氧暴露组(H0)。低氧结束后，乙醚麻醉小鼠。进行实验之前，对各组小鼠进行称重。

1.2.3免疫器官提取及测量 轻压小鼠，眼科弯镊眼静脉放血处死小鼠，取出置于无菌纸上，腹侧面向上，打开腹腔分离并取出脾脏，放入EP管中，进行称量。胸腺的提取方法同上，分离出胸腺，进行称量。注意不要切断大血管及弄破心脏，记录数据并进行统计分析。小鼠的胸腺指数=(胸腺重量/小鼠体重)×10(mg/kg)；脾指数=(脾重量/小鼠体重)×10(mg/kg)。

1.2.4IL-2活性测定 方法同提取脾的方法，手持镊子夹住脾被膜，并用hand，S液反复冲洗，直到脾发白，收集冲洗细胞悬液，1 000 转/min×10 min两次离心，弃去上清，取脾细胞配制成2×106/mL细胞悬液，用 1.0 μg/mL的ConA刺激4 h，接种到24孔20 %小牛血清RPMI1640培养基中，1 mL/孔，置于37 ℃、5 %CO2培养箱中静置孵育24 h，应用ELISA法检测IL-2活性。

1.2.5小鼠腹腔巨噬细胞提取与培养 脱颈处死小鼠后，酒精浸泡小鼠1～2 min，移入超净台中，仰卧固定在解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，用镊子提起下腹皮肤，剪一小口并沿腹中线剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，抽取5 mL预先预冷的不含小牛血清的RPMI1640培养液并注射，注射时不要损伤内脏及血管，用棉球轻柔腹部2-3 min，静置5 min后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取，移入离心管中，并重复灌洗1次。将两次回收的洗液分别1 000 转/min×10 min两次离心，最终弃去上清，调整细胞浓度2×106/mL，接种于24孔培养板中，1 mL/孔，置于37 ℃、5 %CO2培养箱中静置孵育2 h。取上清检测IL-2的含量，取贴壁细胞并用RPMI1640培养基洗1～2次，弃去未粘附细即为单层的巨噬细胞。取少量细胞悬液作台盼蓝染色检测细胞活性、并作瑞氏染色。并用墨汁检测巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。

2 结果与讨论

2.1低氧对小鼠免疫器官的影响 低氧实验模型建立后，称取小鼠免疫器官胸腺和脾的重量，计算胸腺指数和脾指数，低氧4次组小鼠脾指数和胸腺指数均低于对照组(P<0.05)。低氧会使免疫器官的相对指数下降，低氧1次组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 低氧对小鼠对免疫器官的影响

2.2吞噬细胞吞噬百分率、吞噬指数功能的检测 正常成鼠脑缺氧时，吞噬细胞基本功能变化检测，分别检测对照组小鼠、缺氧组1 h和缺氧4 h吞噬百分率及吞噬指数结果见表2。

表2 低氧小鼠对吞噬红细胞影响

2.3各组小鼠血液指标变化 结果可见，白细胞在低氧不同时间段时，细胞数目与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，中性粒细胞在H1、H4与H0相比，中性粒细胞降低(P<0.05)。红细胞则对低氧最为敏感，不同时间低氧组与对照组比较，数目减少(P<0.05)。

表3 各组小鼠血液主要指标的比较

a为与对照组比较P<0.05

3 讨论

应激反应是机体突然遭受强烈有害刺激，通过下丘脑引起腺垂体分泌增多，从而促使肾上腺皮质系统(Hypothalamus pituitary adrenal,HPA)被激活，糖皮质大量分泌，通过下丘脑释放促肾上腺皮质激素释放激素，垂体释放促肾上腺皮质激素，最终导致糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)大量分泌[8]。产生的反应是局部或全身的应激反应，这种反应与刺激物无关，不具有特异性，通常被认为有适应性意义，但是应激对动物有破坏性一面，比如适应性疾病，下丘脑-脑垂体-肾上腺皮质活动增强，这些器官的激素分泌增加，同时GCs作为HPA系统的终产物，具有免疫抑制作用，可抑制巨噬细胞(macrophages,Mф)对抗原的吞噬和处理，抑制淋巴细胞增殖和细胞毒性及抑制TNF-а、IL-2和IFN-γ的分泌，综上所述，低氧的极端环境不仅对免疫系统有抑制作用，而且对血液循环等其他系统也有相对影响。但数据充分证明低氧对免疫系统的抑制并不是呈正比的。而是在多次的低氧中产生耐受力。说明机体免疫系统的调节是主动的。可以积极面对这种极端环境。在医疗领域，我们可以通过低氧调节，降低人体代谢率，对于一些身患绝症的患者，延长其生存时间。使其治疗时间延长，可以增加患者的治愈机会。

本研究结果显示，低氧严重会对胸腺脾等免疫器官造成负面影响。随着低氧次数的增加脾和胸腺指数分别下降11.12 %、0.5 %。实验中观察发现随低氧次数增加，小鼠在低氧环境的生存时间也越长，说明机体对极限环境的抵抗能力也有所提升。结果可见随低氧次数增加，1次低氧巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数下降4.61 %、0.2 %。而低氧4次吞噬百分率、吞噬指数略有减少甚至有升高趋势，说明吞噬细胞可能适应了低氧环境的吞噬能反而提升。观察结果可见血红蛋白浓度在第一次低氧中呈上升趋势，而后又恢复到正常值。血小板数目在低氧实验中变化不大。说明低氧对机体凝血功能无影响。实验数据证明淋巴细胞数目在低氧环境中呈下降趋势，但其对低氧有一定抵抗能力。综合本表内容，低氧对于血液营养运输和免疫系统有一定抑制作用，尤其是对于血液营养运输影响最大，但都限制在一定范围内，说明机体对低氧的极端环境有很强的调节和抵抗能力。