蒙古黄芪总皂苷对铅染毒大鼠学习记忆损伤的保护作用*

蔚立涛，赵秉宏，李 鑫，周劭华，高 磊，赵宇航，关明杰

(内蒙古科技大学包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头 014060)

铅是一种具有全身毒性的重金属，主要通过呼吸道、消化道和皮肤接触等方式进入人体内[1]，易摄入蓄积，难以排除。目前我国儿童血铅的平均为26.7 μg/L，其中超过50 μg/L的占8.6 %[2]，铅污染处于低水平持续状态。铅对生长发育各阶段均有严重损伤，以神经系统受损最常见、持续时间最长。儿童处在体格发育的关键时期受到铅暴露危害最重，主要临床表现是学习记忆能力差、智力发展缓慢等[3]。铅对神经系统损伤机制复杂。铅可以提高组织的氧化应激水平，机体内过量自由基导致神经系统处于亚健康状态，常常会出现学习记忆能力减退现象[4]。目前对铅暴露的治疗方法主要是驱铅疗法，但该疗法严重干扰机体微量元素平衡，因此患者及其家人依从性差。预防手段主要是降低生产和加工中铅的使用量，减少儿童接触等。因此，本团队基于预防干预思路，结合发展内蒙古本地特色中医药思想，提出尽早应用中医药预防铅暴露导致的学习记忆能力下降，更好的促进儿童健康成长。

蒙古黄芪是内蒙古地区道地药材，有关资料最早记载于《神农本草经》[5]，是多部中药组方的重要成分。随着中药有效成分提取加工技术提高，蒙古黄芪通过提取加工，可以得到蒙古黄芪总皂苷、总黄酮、总多糖和氨基酸等成分[6]。已有研究表明蒙古黄芪总皂苷具有抗炎、抗氧化、抗衰老等功效[7]。本团队已用蒙古黄芪总皂苷治疗ADHD模型SHR大鼠，结果显示对多动、冲动和学习记忆损伤有治疗作用[8]，具有良好的神经保护功效。本研究在此基础进一步研究蒙古黄芪总皂苷对铅染毒大鼠学习记忆损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 45只清洁级4周龄SD大鼠，体重(55±10)g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于洁净恒温21～23 ℃，相对湿度为35 %～45 %的动物房内。

1.1.2药物与试剂 蒙古黄芪总皂苷是用60 %乙醇从蒙古黄芪粗粉中提取得到：第1次用10倍粗粉的乙醇量提取120 min，第2次用8倍粗粉的乙醇量提取90 min，两次提取液合并后回收乙醇至无味，将浓缩物干燥得到蒙古黄芪总皂苷。通过紫外可见分光光度计(UV)检测含量为98.22 %。醋酸铅试剂生产厂家是上海试剂有限公司。检测大鼠血清丙二醛、超氧化物歧化酶、脑源性神经营养因子ELISA试剂盒生产厂家是江苏酶免实业有限公司。

1.1.3仪器 水迷宫，成都泰盟科技有限公司。多动能酶标仪，美国BioTek有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及给药 适应性喂养7 d，将45只SPF级雄性SD大鼠用完全随机法等分为阴性组、模型组、蒙古黄芪总皂苷高(0.1500 g/Kg)、中(0.0750 g/Kg)、低剂量(0.0375 g/Kg)组。阴性组用饮用水，其余组饮用0.2 %醋酸铅溶液造模。每早8时灌胃，按10 mL/kg体重的量给药，阴性组和模型组给与等容量生理盐水。

1.2.2水迷宫实验 目前水迷宫实验是学术界公认的评价动物学习记忆能力的测试方法，分为定位巡航、逃避潜伏期、隐蔽平台三阶段[9]。本实验在给药4周初开始水迷宫实验第1天，随机将动物放入迷宫中自由游泳2min，适应水中环境；第2-5天将动物以不同象限中点背朝池壁放入迷宫，完成逃避潜伏期实验；第6天，撤去平台，将大鼠从第三象限中点背朝池壁放入迷宫，记录2min内大鼠第一次到达平台所用时间，在平台以及所在象限停留时间比率和进入目标象限次数。本实验需要实验员熟练掌握水迷宫机器，适时调节定位光线，用电灯作为光来源可以减少自然光变动影响。

1.2.3酶联免疫吸附实验检测血清MDA、SOD和BDNF含量 药物干预4周后，末次给药结束开始计时，禁食不禁水12 h。腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉后，用采血针和用促凝管采集腹主动脉血液5 mL静置30 min，以3 000 r/min、10 min取上清，分装1次用量到灭菌EP管中，冻存于-20 ℃冰箱内。按照大鼠血清MDA、SOD和BDNF酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒说明书逐步进行检测。

1.2.4统计学方法 用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料符合正态分布时，用单因素方差分析，组间比较用SNK法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1水迷宫实验结果 与阴性组比较，模型组入水后第一次到达平台所用时间长，在平台及其所在象限停留时间比率低，进入平台所在位置次数少，差别有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，蒙古黄芪总皂苷高中低剂量组第一次到达平台所用时间短，在平台及其所在象限停留时间比率高，进入平台所在位置次数多，差别有统计学意义(P<0.05)。药物组之间比较，皂苷高剂量组第一次到达平台所用时间短，在平台及其象限停留时间比率高，进入平台次数稍高，但差别无统计学意义(P > 0.05)，尚不能认为药物剂量对上述指标有影响。见表1。

表1 各组水迷宫实验结果

2.2各组血清MDA、SOD和BDNF结果 与阴性组比较，模型组血清中MDA含量升高，SOD、BDNF含量降低，差别有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，蒙古黄芪总皂苷血清中MDA含量降低，SOD、BDNF含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。药物组之间比较，以上指标差别无统计学意义。见表2。

表2 各组血清MDA、BDNF和SOD含量

3 讨论

铅是生活中常见的重金属污染物，对儿童青少年危害严重，主要累及神经、消化、造血等系统。近年来，生产生活中添加的铅及其制品逐渐减少，铅污染逐渐向低水平长期暴露模式发展，这种隐患对青少年神经损伤更为严重。研究发现，儿童血铅升高1.22 μg/L，智商降低一个百分点[10]，学习成绩下降，记忆能力减退[11]。目前国内外科学家纷纷致力于寻找预防低水平铅暴露损伤方法，但是效果均不够理想。本团队采用传统中医药蒙古黄芪有效活性成分总皂苷，探索其对铅暴露预防效果。基于临床实验，受到知情同意、对病人无害等伦理学的种种条件限制。本课题组前期已有动物实验基础[12]，加之SD大鼠易饲养、成本低，能够完全满足本次研究要求，因此我们采用SD大鼠为研究对象。

水迷宫实验是评价大鼠的学习记忆能力的实验，能够很好的评估动物学习记忆效果[9]。本研究与阴性对照组比较，模型组第一次到达平台所在位置的时间增加，在平台及其所在象限内停留时间比率低，进入平台所在位置次数少，差别均有统计学意义，说明铅暴露SD大鼠的学习记忆能力降低。与模型组比较，给药各剂量组第一次到达平台所用时间短，在平台及所在象限停留时间比率高，进入平台所在位置次数多，差别有统计学意义。说明药物组的学习记忆能力强于阴性组。给药各剂量组与阴性对照组比较，上述指标均无统计学意义。提示蒙古黄芪总皂苷对铅染毒大鼠的学习记忆损伤有保护作用，本实验尚未发现总皂苷剂量和学习记忆保护作用之间有量效关系。

铅的毒性主要体现在脂质过氧化和活性氧增加。铅暴露大鼠自由基增加和抗氧化物质的不足导致氧化抗氧化失衡[13]。血清中脂质过氧化标志物MDA属于氧化物质，谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)等[4, 14]属于抗氧化物质。Ahmad等研究表明铅对机体的危害机制可能是产生自由基等氧化应激、损伤细胞以及扰乱电解质平衡等，铅暴露大鼠血清SOD、过氧化氢酶(CAT)等水平显著降低，MDA含量显著升高[15]。研究发现血清中MDA水平升高和(或)SOD降低反应机体的氧化应激水平提高，反之机体氧化应激水平降低[16]。Joanna等研究血清中BDNF降低和学习记忆认知水平下降相关[17]。本研究选择检测血清MDA、SOD和BDNF分别探测氧化程度、抗氧化程度和对认知影响的指标，探讨蒙古黄芪总皂苷对铅染毒大鼠的抗氧化与神经保护可能机制。与阴性组比较，模型组血清中MDA含量降低， SOD、BDNF含量增加，差别有统计学意义，结果表明铅暴露大鼠血清氧化应激水平提高。与模型组比较，蒙古黄芪总皂苷血清中MDA含量降低，SOD 、BDNF含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。本结果与张海英等报道的结果一致[18]。蒙古黄芪总皂苷对血液中氧化应激指标起调节作用，一方面降低MDA含量降低氧化程度，另一方面升高SOD 、BDNF发挥抗氧化和神经保护作用。

综上所述，蒙古黄芪总皂苷具有防治铅暴露大鼠的学习记忆能力损伤作用，可能是降低血清中MDA含量，升高血清中SOD和BDNF含量，发挥降低氧化物含量、提高抗氧化能力和神经保护的机制。