姜黄药渣真菌分离方法的改良及真菌多样性分析*

兰咏哲， 李启瑞， 黄劲， 赵亮， 董宇华， 阚雨， 王迪, 廖万清， 康颖倩*

(1.贵州医科大学 基础医学院 微生物学教研室， 贵州 贵阳 550025; 2.贵州省微生物与人类健康关系研究人才基地 & 贵州省普通高校病原生物学特色重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学教研室, 贵州 贵阳 550025； 4.中国人民解放军海军军医大学 上海长征医院真菌学研究所， 上海 200003)

姜黄(Curcumalonga)为姜黄芭蕉目、姜科，属多年生草本植物[1]，其根茎发达，根粗壮，末端膨大呈块根，广泛栽培于我国西南、西北地区[2]。姜黄在中国中草药领域已经应用了上千年，其特有的姜黄素具抗炎、抑菌、降糖、抗氧化及促进创口愈合等多种生物学活性[3-4]。姜黄药渣以植物根茎组织为主，含有植物纤维、蛋白质、多糖及残留的药物成分[5-6]，我国每年姜黄药渣的排放量达3 000万吨[7]。目前，利用投加具有高效降解木质纤维素的微生物对药渣发酵堆肥的方式已成为国内外药渣处理的研究热点[8-9]。研究发现，降解木质纤维素的主要是丝状真菌[10]，研究者多用添加外源微生物的方式对药渣进行发酵[11-12]，但姜黄药渣本身具有一定的抑菌作用[13-15]，可能会抑制一些微生物的生长，降低发酵效率。有研究者发现，可从不同的混合药渣中分离到具高效水解药渣中木质纤维素的菌株，特别是一些菌株可有效地抵抗周围环境而顽强地生存，证明从药渣及其堆放环境中分离对药渣有降解效果的真菌方法是有可行性的[16-18]。在分离方法上，研究者常采用平板划线、平板稀释涂布等方法分离生物质中真菌[19-21]，但由于姜黄药渣具有一定的抑菌效果，采用传统的真菌分离方法效果不佳，难以分离出真菌[14]。有学者发现，先对生物质进行摇床富集培养，可有效地提高菌株的分离率[21]。此外，采用植物组织分离法对植物组织块进行预处理也可以有效地对植物内生真菌进行分离[9]。因此，本研究结合多种方法对姜黄药渣真菌分离方法进行改良，探究姜黄药渣中真菌的多样性，为筛选具有降解姜黄木质纤维素能力的真菌菌株，解决姜黄药渣堆放污染环境的问题打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药渣来源 从贵州正业集团堆放姜黄药渣的环境中，参照文献[22]采集5处姜黄药渣样本。

1.1.2主要试剂与仪器 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD；美国BD)，青霉属及链霉素(上海生工)；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、Genstar PCR MIX、T100 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪及电泳仪(美国 BIO-RAD)，Thermo 17R小型台式高速离心机及HH-B11恒温培养箱(上海跃进)。

1.2 方法

1.2.1药渣真菌常规分离法 取大小适当的姜黄药渣组织块，无菌生理盐水洗涤3次，置于灭菌的酵母膏胨葡萄糖链霉素及青霉属抗性培养基[18]，25 ℃恒温摇床孵育3～7 d，每个样本重复3次，将培养基上生长的菌株以划线法接种于YPD固体培养基上，25 ℃恒温培养3～7 d，分离培养至获得单一菌种。

1.2.2药渣真菌改良法 采用植物组织分离法[22]处理姜黄药渣：取大小适当的姜黄药渣组织块用无菌生理盐水洗涤3次后，用无菌手术刀将组织块切开，分成均匀小块，取直径0.5 cm的组织块置于锥形瓶中，加入无菌ddH2O 150 mL，25 ℃恒温摇床孵育6 h；将震荡均匀的菌液静置30 min，吸取适量上清液，接种于酵母膏胨葡萄糖琼脂链霉素及青霉属抗性培养基，25 ℃恒温倒置孵育3～7 d，每个样本重复3次；将培养基上生长的菌株以划线法接种在YPD固体培养基上，25 ℃恒温孵育3～7 d，分离培养至获得单一菌种。

1.2.3菌株的分离及鉴定 分别采用常规分离方法及改良方法对5个姜黄药渣样本进行菌株的分离，每个样本重复3个平板；纯化后的菌株按Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒的操作步骤提取DNA，通过PCR扩增其转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)基因序列后送公司测序；将测序结果在美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)中与已知菌株进行相似度比较，并结合菌株的形态，鉴定种属[23]，并计算分离率[24]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 菌株的分离

采用常规方法和改良方法分别从5个姜黄药渣样本中分离获得菌株13株和222株，前者分离菌株均数低于后者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 常规方法与改良方法分离的菌株数Tab.1 Comparison results of two methods for isolate strains

2.2 真菌的多样性

2种方法分别从姜黄药渣样本中分离获得的真菌菌株13株和222株，常规方法分离出的13株菌株分属于2个门5个属的6个菌种，改良方法分离出菌株分属于3个门12个属的20个菌种；青霉属均为优势菌属，分离率分别为61.53%、46.84%(图1)；Aspergillusminisclerotigenes分离出的菌株均最多，分别为5株、58株，为优势菌种(图2)。

图1 常规方法及改良方法分离菌株的菌属比例构成Fig.1 Composition of the genus ratio of the conventional method and the improved method

图2 常规方法及改良方法分离菌株的菌种分布情况Fig.2 Distribution map of strains was isolated by the conventional method and the improved method

3 讨论

生物质资源具有很高的利用价值，但生物质微生物利用的过程中往往存在有效菌株难以分离的问题，如姜黄药渣中姜黄素的抑菌作用[3]、酒糟的酸性环境[23]、茶渣中含有的茶多酚具有较强的抗氧化功效[13]等，这些因素都是导致菌株难以分离的原因。本次研究对姜黄药渣真菌的分离方法进行了改良，结合了摇床培养及植物组织分离的方法，其中采用植物组织分离法对姜黄药渣进行预处理，可提高药渣组织各部分与培养基的接触，并且可以分离出姜黄药渣中的内生真菌，这些真菌往往也具有木质纤维素降解能力。此外，以姜黄药渣为唯一碳源进行摇床富集培养，可有效提高菌株的分离率。在本次研究中采用改良方法从采集的5个姜黄药渣样本中分离出真菌菌株222株，每个样本分离出的菌株均数大于常规平板分离方法(P<0.05)，有效提高了姜黄药渣真菌菌株的分离率，为中草药药渣及其他生物质中菌株的分离提供了思路。

本研究中，采用常规方法及改良方法分别从姜黄药渣中分离获得真菌菌株13株、235株，其中曲霉属分离率分别为61.53%、46.84%，均为优势菌属；采用常规方法分离到的5个菌属的6个菌种，在改良方法中都可以被分离获得，且优势菌属及菌种均未改变，这说明改良方法不会影响样本中真菌菌株的多样性。此外，曲霉作为发酵工业和食品加工业的重要菌种，常活跃在人们的视野之中[24]。在其他生物质(如大白花杜鹃根[25]、沙冬青[26])微生态中，球囊霉属、无梗囊霉属及树粉孢属等菌属往往为优势菌属，与姜黄药渣存在着一定的差异，这可能与姜黄所特有的性质有关[17]。

本研究还从药渣中分离出了根毛霉属、假丝酵母菌属、红酵母属菌、蓝状菌属、轮层炭壳属、伞菌属、茶叶籽酵母属、锥毛壳属、毛霉属及栓菌属的菌株。其中，毛霉属、根毛霉属主要以腐生的方式生活，具极强的蛋白质分解能力，毛霉属的一些菌种甚至被报道过有降解木质纤维素的能力[22]。假丝酵母菌属为一类常见的深部感染真菌，种类很多，但能够引起人类致病的仅有几种，一些菌种也可以利用脱落的植物枝叶进行生长[27]。红酵母属的真菌为一些单细胞真菌，对周围环境的适应能力很强，可产生荚膜使菌落呈粘稠状，往往被认为是引起动植物致病的原因。此外，轮层炭壳属、伞菌属、锥毛壳属及栓菌属的菌株都常被报道存在于植物脱落的组织周围，可有效地利用植物组织生长，对木质纤维素都具有一定的降解作用[28]。这为后续进一步筛选具有降解木质纤维素能力的菌株提供了依据。