胶原诱导性关节炎小鼠脾脏树突状细胞的检测及意义*

范友羊， 刘俊， 周海燕， 曾家顺， 李龙*

(1.贵州医科大学附属医院 肾病风湿科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 临床医学研究中心， 贵州 贵阳 550004)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，主要以关节滑膜炎症为主要病理改变[1]。全球RA的发病率为0.5%～1%，我国大约为0.42%，目前RA患病的人数仍在增加[2]。研究RA最为常用的动物模型是胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型，其原因为CIA在临床症状和病理表现方面与人RA非常相似[3]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内最强大的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，也是唯一能激活初始型T淋巴细胞的抗原提呈细胞，在T细胞参与的细胞免疫反应中起重要的作用[4]。研究表明，DC的亚群和功能状态可以直接影响初始T细胞分化为具有不同功能的抗原特异性T细胞的过程[4]。本研究拟通过建立CIA模型，采用流式细胞术检测脾脏淋巴组织驻留型经典DC(conventional DC，cDC)及其各亚群的比例，分析这些指标与CIA疾病的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

SPF级近交系DBA/l小鼠12只，雄性，6～8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证编号SCXK2017-0005。鸡Ⅱ型胶原(chicken collagen type Ⅱ，CⅡ)和完全弗氏佐剂(Sigma公司)，APC-cy7标记抗小鼠CD3e抗体、BV421标记抗小鼠CD4抗体、PerCP-Cy5.5标记抗小鼠CD8a 抗体、PE-cy7标记抗小鼠CD19抗体、PE-CF594标记抗小鼠CD11c抗体、BB515标记抗小鼠 I-A/I-E抗体、组织脱水机、石蜡包埋机、手动切片机及光学显微镜(德国徕卡)，冷冻离心机(美国赛默飞世尔公司)。

1.2 方法

1．2．1分组及小鼠CIA模型的建立 将12只雄性DBA/l小鼠分为正常组(n=6)和模型组(n=6)，模型组小鼠参照经典的CIA模型方法[5]，将CⅡ与弗氏完全佐剂1 ∶1等比例混合，置于冰浴，注射器反复抽吸、充分研磨至完全乳化，取完全乳化剂0.1 mL在小鼠尾根部多点皮内注射。初次免疫后第21天，同剂量加强免疫1次。正常组小鼠注射同剂量0.9%氯化钠溶液。

1．2．2CIA模型评估 从加强免疫后，开始每隔3 d记录小鼠体重及足爪关节肿胀情况，共观察3周。关节炎指数(arthritis index，AI)评分衡量关节的病变情况，参考文献[6]进行评分。未出现红肿记0分，出现足趾关节红肿记1分，趾关节、足跖均红肿记2分，踝关节以下均出现红肿记3分，包括踝关节全部出现红肿记4分；每只爪子均评分，最高评分为16分。第45天处死小鼠后切取右后肢踝关节，剔净毛发及肌肉，将关节浸泡于4%多聚甲醛溶液中，固定3 d后放入10% EDTA 液中，脱钙1～2周,常规石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，普通光镜观察小鼠踝关节情况。

1．2．3流式细胞仪检测脾脏DC亚群及比例变化 第45天脱颈处死小鼠，打开腹腔取出小鼠脾脏，去包膜后切成0.2 cm×0.2 cm的脾片，置于含RPMI-1640细胞培养液的平皿中碾磨，200目网筛过滤获得细胞悬液；PBS冲洗收集细胞悬液，常温离心(1 000 r/min，10 min)；弃上清后加入红细胞裂解液2 mL；避光孵育8 min，离心弃上清，将细胞调整为1×109L(台盼蓝染色活细胞数>95%)，分别加入APC-cy7标记抗小鼠CD3e抗体、BV421标记抗小鼠 CD4抗体、PerCP-Cy5.5标记抗小鼠CD8a 抗体、PE-cy7标记抗小鼠CD19抗体、PE-CF594标记抗小鼠CD11c抗体和BB515标记抗小鼠 I-A/I-E抗体，各1 μL，混匀，4 ℃放置 30 min ，PBS洗涤2次，PBS 0.5 mL重悬细胞，上机检测，所测结果使用 FlowJo 10 软件分析。参照文献[7]排除T细胞CD3+和B细胞 CD19+后，以CD11c+MHCⅡ+细胞占脾单细胞数量反映cDC数量，分析CD8+cDC、CD4+CD8-cDC、CD4-CD8-DC各亚群比例的变化。

1．3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠关节情况及AI评分

造模期间，小鼠均未死亡。对照组小鼠精神饮食正常，行动自如，关节无红肿；模型组部分小鼠从加强免疫第3天后开始出现关节红肿等表现，随着时间的延长，模型组小鼠均出现明显的关节红肿、行动迟缓等表现(图1)。与对照组比较，模型组AI评分升高，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。HE染色显示，对照组小鼠踝关节结构完整，未见炎性细胞浸润及新生血管形成；模型组小鼠踝关节结构被破坏，关节软骨可见明显坏死脱落、纤维化，并有大量炎细胞浸润，新生血管增生(图3)。

对照组 模型组图1 2组小鼠第45天后爪外观Fig.1 Appearance of mouse hind paw between two groups on the 45th day

注：(1)与对照组比较，P<0.05。图2 2组小鼠AI评分的比较Fig.2 Comparison of AI scores between two groups

对照组 模型组图3 2组小鼠第45天踝关节组织HE染色(100×)Fig.3 HE staining of ankle joint tissue between two groups on the 45th day(100×)

2.2 脾源性cDCs细胞及各亚群比例比较

流式细胞数据表明，与对照组比较，模型组小鼠脾脏cDC及CD4+CD8-cDC比例降低，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组小鼠CD8+cDC比例变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组CD4-CD8-cDC比例升高，差异有统计学意义(P<0.05) 。见图4。

注：(1)与对照组比较，P<0.05。图4 2组小鼠脾脏第45天cDCs细胞及亚群及比例变化Fig.4 Changes of subgroups and proportion of spleen cDCs cells between two groups on the 45th day

3 讨论

RA是一种累及全身关节的自身免疫性疾病,其疾病的进展由多种诱发因素和机体免疫异常造成。尽管目前关于RA的具体发病机制仍存在大量争议，但大多数学者认为 RA 是一种以Th1/Th17 免疫应答为主的慢性炎性疾病。疾病的过程主要涉及APC对自身抗原的异常提呈。而DC是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，具有启动和诱导初始型 T 细胞、促进辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞的生成的作用[8]。DC起源于骨髓多能造血干细胞，在骨髓中形成，然后以非成熟状态迁移到外周。根据其表型、组织分布和功能可分为不同的亚型。对于小鼠体内的DCs亚型，常根据表型和功能的不同分为cDC和浆细胞样DC(plasmacytoid DC,pDC)，这两大类广泛分布于外周血、淋巴组织和非淋巴组织中[9-11]。DC领域大部分研究工作都围绕cDC展开。根据组织定位的不同又将cDC分为不同的亚型，cDC分为迁移型cDC(又称非淋巴组织cDC)及淋巴组织驻留型cDC。在小鼠的脾脏中主要以淋巴组织驻留型cDC为主，其主要可以分为CD8+cDC和CD8-cDC两个亚群，而CD8-cDC亚群又根据是否表达CD4+，将其分为CD4+CD8-cDC和CD4-CD8-cDC两种类型。其中CD8+cDC约占脾脏cDC的20%～30%，主要分布在T细胞区，收集来自淋巴和血液转移过来的抗原和病原体[12]。CD8+cDC与CD8-cDc亚型相比，CD8+cDC亚群主要通过MHC-I途径提呈抗原，其能更有效的交叉提呈OVA模式抗原，活化CD8+T细胞[13]。同时CD8+cDC也能刺激TH1细胞产生极化细胞因子IL-12p70，而诱导CD4+Thl应答的关键细胞因子就是IL-12p70，这表明CD8+cDC能直接刺激Thl型T细胞免疫应答[14]。CD8-cDC主要分布于脾边缘地带，在脾脏cDC中含量最多，约占脾脏总DC的50%～60%，研究发现，在LPS或者TLR刺激下CD8-cDC会重新迁移到T细胞区从而刺激激活初始CD4+T细胞活化，产生炎性趋化因子，诱导TH2免疫应答反应[14]。CD8-cDC与CD8+cDC有些差异，CD8-cDC主要通过MHC-II类分子途径将外源性抗原提呈给初始CD4+T细胞，其过程依赖于C-型凝集素受体如Dectin1等实现[15]。关于CD4+cDC和CD4-cDC两个亚群的研究非常有限，有时甚至相互矛盾。Hochrein等[16]首次报道CD4-cDC在TLR刺激后能更有效的促进IL-12的分泌，而另外2项研究表明，2组亚群的cDC在利什曼原虫感染后其对IL-12的分泌影响无显著差异[17-18]。Proietto等[19]也有报道称CD4+cDC在TLR刺激后是炎性趋化因子的主要产生者。在稳态和应激条件下研究CD4+cDC和CD4-cDC两个亚群在OVA肽活化后对CD4+T淋巴细胞分化的影响，研究发现两种亚群均能同样启动CD4+T淋巴细胞，并引起混合反应。然而，值得注意的是CD4-cDC以分泌IL-12独立的方式将反应偏向Th1方向[18]。Emilie等[20]研究发现，稳态环境下，使用OVA肽激活DC和CD8-cDC两个亚群在启动CD4+和CD8T+淋巴细胞免疫应答的能力是一样的，相反的是，当用iNKT细胞激活剂a-GalCer激活时，CD4+cDC和CD4-cDC两个亚群在体外和体内激活和(或)分化iNKT细胞的能力明显不同。本研究发现，在CIA小鼠脾脏中淋巴组织驻留型cDC明显下降，其可能原因为脾脏中的cDC迁移至滑膜关节组织参加炎症反应，而其各亚群中CD8+cDC亚群无明显差异，CD4-CD8-cDC亚群明显升高，CD4+CD8-cDC亚群明显降低，表明树突状细胞各亚群的变化与RA密切相关，其具体机制有待进一步研究。