基于网络药理学分析重用生白术组方治疗小儿功能性便秘的作用机制

梁学玲 秦艳虹

1 山西中医药大学(太原 030000) 2 山西中医药大学附属医院( 太原 030000)

小儿便秘[1]为临床常见病、多发病，其严重危害小儿的身心健康；一般是指非器质性病变的各种原因所导致的粪便在肠内滞留时间过久，秘结不通，排便周期延长，或周期不长，但粪质干结，排出困难，或粪质不硬，虽有便意，但便而不畅的病症。目前，国内外“便秘诊治指南”多数认为便秘属于功能性胃肠病[2]。因其发病受地理环境、种族特征、饮食习惯、家庭教育等各种因素的影响，故本病的发病率报道各异。根据流行病学的统计，在正常小儿群体中，其便秘发病率为0.2%～28%[3]。如此高的发病率已严重影响小儿的健康成长。因此，如何有效治疗小儿便秘意义重大。白术[4]：菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎，以浙江、湖南、湖北等为主要产地。其味甘、苦，性温。归脾、胃经，功效为益气健脾、燥湿利水、止汗、安胎等。临床广泛应用于脾气虚证、气虚自汗及脾虚胎动不安等病症。目前，针对小儿便秘的药物以酪酸梭菌活菌片、麻仁软胶囊、开塞露、小儿消食颗粒等为主。导师秦艳虹教授在临床中重用生白术治疗小儿功能性便秘取得了较好的疗效，但具体的作用机制尚未见有关报道。

小儿脏腑娇嫩，常可见五脏六腑功能状况不够稳定、发病传变迅速。饮食稍有不慎，易出现食积、便秘等症[5]。白术具有益气健脾、燥湿利水的功效，很少见白术用于治疗小儿便秘。但现代药理研究[6]发现白术可通过影响乙酰胆碱(Ach)和P物质(SP)两个胃肠道最重要的兴奋性神经递质的分布以促进肠道运动。经查阅文献可知关于白术治疗便秘的最早记载为张仲景所著方书之祖《伤寒论》。原文第174条[7]：“伤寒八九日，风湿相搏，身体疼烦，不能自转侧，不呕不渴，脉浮虚而涩者，桂枝附子汤主之；若大便坚，小便自利者，去桂加白术汤主之”。《本草正义》云白术“最富脂膏, 虽苦温能燥, 而亦滋津液”“以其丰于脂膏, 故宜于煎剂”“万无伤阴之虑”。说明白术通便, 机制主要是健脾助运, 津液得行, 且质润生津滋液, 二者相佐, 大便得通。清代王泰林在《王旭高医书六种》中道[8]“白术生肠胃之津液，大便硬是肠胃之津液干枯，故加白术”，道出生白术可润肠通便的机理。当代最先见于北京名中医魏龙骧先生，他在《医话四则：白术通便秘》中说到“故余治便秘，概以生白术为主，少则一、二两，重则四、五两，便干结者加生地以滋之，时或少佐升麻，乃升清降浊之意”[9]，其认为大便干结是由于阴津亏少，肠道失于濡润。但若单纯专于滋润，而不健运脾土，则脾不能为其行津液，属治标，重用生白术运化脾阳，实为治本之意[10]。陶贤周[11]在临床中重用生白术治疗老年人便秘效佳。朱树宽[12]认为生白术30 g以下，可起到益气健脾的功效，专于补，而用至30 g以上，则专于通利。中医传统观念认为，改善肠道津液的状况，增强肠道蠕动能力是治疗便秘的关键之所在。生白术可健脾益气，脾主为胃行其津液，津液得行则燥便得通。导师秦艳虹教授总结前人经验，结合自身多年临床经验认为重用生白术特别适用于小儿功能性便秘，认为“增水行舟”是治疗便秘的基本大法。

中药具有多成分、多途径、多层次和多靶点的特点[13]，很难明确中药药效的物质基础及其作用机制。许多学者尝试用现代医学解释中药的作用机制。网络药理学[14]是基于系统生物学理论，对生物系统的网络进行分析，选取特定信号节点进行多靶点药物的分子设计的新学科，是建立在高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及其网络数据库检索基础上的生物信息网络构建及网络拓扑结构分析策略和基数基础上的实验方法。 目前，网络药理学因其数据获取渠道多、种类丰富、涵盖面广、能对抽象且庞大的数据内容进行可视化分析等特点，被应用在临床医学、药学、生物信息等多个学科领域数据处理过程中[15-16]。 网路药理学[17]这一概念于2007年由英国药理学家Hopkins率先提出，是基于系统生物学和多向药理学等学科理论，从多维度视角理解药物干预疾病的分子机制。研究表明，通过网络药理学的方法研究中药的作用机制符合中医药整体观念，方法准确，结果可信度高。如林适等[18]运用网络药理学研究骨碎补治疗骨质疏松症的作用机制，得出其有多靶点、多通路、多系统的特性的观点。黄启和等[19]应用分子对接技术筛选延胡索抗心肌缺血物质的基础研究，认为其含有治疗心肌缺血主要的物质基础。马新称等[20]运用网络药理学理论研究钩藤治疗高血压的作用机制，为其临床应用提供依据。很多学者均运用此方法研究中药的分子机制，为深入研究重用生白术防治便秘的作用机制奠定了基础。本文以生白术为研究对象，采用网络药理学方法，探究生白术防治便秘的作用机制，为临床治疗便秘提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 筛选化学成分及相应靶点

以口服生物利用度(OB)>30%，并且化合物类药性(DL)>0.18为筛选条件[21]，从TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中检索白术的化学成分并收集化合物的相应靶点。其中生物利用度和类药性是筛选化合物的重要指标，值越高，表明越有可能被开发为临床药物。

1.2 便秘相关靶点的获得

从Gene Cards、OMIM共2个疾病相关靶点的数据库中检索便秘相关靶点，筛选关键词设置为“constipation”,设定物种为“Homo sapiens”。

1.3 药物靶点和疾病靶点交集

利用R语言，对“1.1”“1.2”所得到的药物预测靶点和疾病靶点集合的靶点名称，取交集。

1.4 中药调控网络构建

根据上述的靶点预测结果，采用Cytoscape 3.7.1构建药物-成分-基因-疾病的思维网络模型图。在网络中，用不同的形状表示药物、化学成分、交集基因、疾病等信息，连接线表示两节点间存在关联或映射关系。并利用STRING在线数据库(http://string-db.org/)进行蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络的构建，获得清晰的可视化框架，以便于筛选关键基因。

1.5 基因本位论分析

基因本位论(GO)[22]是描述基因产物功能并广泛应用于生物信息学领域的一个本体。本次研究采用R语言中的CludterProfiler包对生白术-便秘交集靶点进行GO富集分析，以P值反映蛋白质生物功能的显著性(P<0.05表示有显著性)。

1.6 KEGG通路富集分析

应用R语言中的CludterProfiler包对生白术-便秘交集靶点进行KEGG富集分析，筛选出显著富集的通路。当P<0.05时，则可以认为其是具有显著性的关键性通路；P值越小，显著程度越高。

2 结 果

2.1 生白术-便秘交集靶点的预测结果

检索得到白术中有效成分数目为7个，预测靶点数目为774个。通过GeneCards数据可筛选获得疾病靶点2 859个，取药物与疾病靶点的交集，共五个。具体有效成分见表1，筛选后药物靶点见表2，交集靶点见图1，网络可视化图谱见图2。(图中，八边形代表药物，菱形代表疾病，长方形代表中药有效成分，椭圆形代表筛选获得的交集基因)

表1 白术筛选后得到的7个活性成分

表2 白术对应药物靶点信息

续表

图1 生白术-便秘交集图

图2 生白术-便秘“有效成分-有效靶点”网络

2.2 PPI网络图

利用STRING数据平台，将药效团匹配得到的5个共同靶标进行蛋白互作分析，结果发现其中4个靶标可发生相互作用(1个靶标未参与蛋白互作)，其包含10条相互作用的边。由结果知毒蕈碱性胆碱受体M1(CHRM1)和其他蛋白的互相关联程度最高，说明其可能参与的药理作用最明显。蛋白互作网络见图3。

图3 生白术-便秘靶蛋白PPI网络

2.3 生白术-便秘疾病交集靶点的GO分析结果

GO分析结果显示，5个靶点共计富集26项生物过程，包括神经递质受体的活动、乙酰胆碱受体的活动，磷脂酰肌醇磷脂酶活性、G蛋白偶联神经递质受体活性、磷脂酶C活性、神经递质结合等，见图4和图5所示。

图4 生白术防治便秘活性靶点GO富集分析柱状图

图5 生白术防治便秘活性靶点GO富集分析气泡图

2.4 KEGG通路富集分析结果

对5个生白术-便秘交集靶点的KEGG通路富集分析结果显示，P<0.05的生白术治疗便秘所涉及的信号通路有6个，分别为胆碱能突触、钙信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、神经活性配体-受体相互作用、CAMP信号通路、磷酸肌醇-3(PI3K)-蛋白肌酶B(AKT)信号通路来治疗便秘。(图6为胆碱能突触信号通路)

图6 胆碱能突触信号通路

3 讨 论

小儿便秘为多因素、多途径引发的较为复杂的疾病。现代药理学研究表明[23]，白术主要含有挥发油、多糖和苷类等，具有利尿、抗菌、免疫调节、消炎的作用，对消化系统也有一定的作用。本文通过网络药理学方法构建生白术的分子作用网络，预测其治疗便秘的作用机制。在构建的“成分-靶点”核心网络中，预测了生白术7种潜在药效成分和2 859个便秘相关靶点。筛选的2种潜在药效成分均作用于PGR、CHRM3、CHRM1、ACHE、CHRM2共5个便秘靶点，体现了中药多成分、多靶点协同作用的特点。

在疾病-成分-靶点网络中，2种药效成分作用于5个便秘靶点，其中CHRM1、CHRM2、CHRM3、ACHE四个靶点相关度较高。已有研究表明，胆碱能神经元末梢的胞质中乙酰胆碱由VACH T负责转运并包装成突触囊泡，在囊泡中储存直到释放，以作用于乙酰胆碱受体[24]。M胆碱受体大量分布在胃肠道平滑肌及腺体等部位，其中CHRM1主要分布在胃壁细胞、神经节及中枢神经系统中，受体接收到乙酰胆碱的激动则会表现出胃肠道及其它脏器平滑肌收缩、腺体分泌增加、胃肠活动加快等效应[25]。胆碱能神经在胃肠运动的神经调控中起重要作用，通过释放乙酰胆碱，作用于胃肠道ICC细胞(Cajal间质细胞是一类特殊的介于神经细胞与成纤维细胞之间的胃肠道间质细胞)膜胆碱能毒蕈碱受体(CHRM)进一步影响平滑肌的收缩[26]。ACHE对胃肠平滑肌收缩有着重要的作用，可研究生理或病理状态下胃肠运动的变化，目前公认的ACHE增强则代表ACHE释放增加，其作用于平滑肌M受体，可开放质膜上L型Ca2+通道，使Ca2+内流而加强胃肠平滑肌收缩[27]。由此推测，生白术可能通过作用于以上靶点发挥治疗便秘的作用。

已有研究发现，治疗便秘的药物机制主要是通过增加肠内兴奋性神经肽表达来刺激肠道蠕动，减少肠内非胆碱能非肾上腺素能神经递质表达来减轻对肠蠕动的抑制，减少黏膜和黏膜下层水肿糜烂程度或炎性细胞数量并保持腺体规整从而达到维护肠道排便功能的目的[28]。本文分析结果显示，生白术治疗便秘参与调节胆碱能突触、钙信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、神经活性配体-受体相互作用、CAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路共6条信号通路。根据预测结果推测生白术防治便秘主要是参与调节胆碱能神经的CHRM1、CHRM2、CHRM3等靶点调节神经活性配体-受体相互作用，G 蛋白偶联受体参与调节钙信号通路、CAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控有关。

总之，本文采用网络药理学方法构建生白术的“成分-靶点-信号通路”网路，从整体上分析其潜在药效成分、靶点、信号通路之间的相互作用关系，从多个角度探讨生白术防治便秘的潜在作用机制。研究结果初步验证了生白术的基本药理学作用和相关作用机制，为进一步深入探讨重用生白术防治便秘作用机制奠定了良好的理论基础，也为临床重用生白术防治小儿便秘提供了理论依据，后期要通过动物实验、基因芯片技术进行验证，以更好的指导临床应用。