木槿皮提取物的挥发性成分分析及抑菌性研究

杨靖，王琼波，费嘉祥，杨鹏飞，刘宛凌,李天笑，白冰，毛多斌

(1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450002；2.漯河医学高等专科学校 食品营养系，河南 漯河 462002；3.河南中烟工业有限责任公司许昌卷烟厂，河南 许昌 461000)

作为一类天然安全的抑菌剂和抗氧化剂，植物提取物在日常的食品保鲜中具有非常广阔的应用前景[1-3]。木槿(HibiscussyriacusL.)，为锦葵科木槿属植物，是一种传统的中草药，其花、叶、皮均可入药，在中国和韩国已有数百年的使用历史[4]，目前，国内外对木槿的研究主要集中在花和叶上。金月亭等[5]发现木槿花提取物具有良好的清除自由基、抗氧化能力和抑菌能力。黄采姣等[6]研究发现木槿花的抗氧化活性与其多酚和总黄酮含量间有极显著的相关性，并从木槿花正丁醇萃取物中初步鉴定出8种抗氧化物质。耿明江等[7]、张婕等[8]采用乙醇对木槿花醇溶性色素进行提取并研究其清除超氧自由基的活性。杨少宗等[9]发现来自浙江苍南和龙泉的紫花重瓣木槿营养价值较高，具有较高的开发利用价值。杨涛等[10]对木槿叶中总酚的提取工艺及抗氧化作用进行了研究。陈磊等[11]对木槿叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性进行了研究。Punasiya等[12-14]研究发现木槿叶不同溶剂提取物的抗氧化效力与抗坏血酸非常接近，其中甲醇提取物中的类黄酮含量最高，具有较强的抗菌活性，对蜡状芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用。Jang等[15]发现木槿皮的热水和70%乙醇提取物对革兰氏阴性细菌和大肠杆菌均有抑制作用，其抑制性与提取物浓度成正比。Kwon等[16]指出木槿根皮提取物具有抗氧化性，且木槿根皮提取物热处理后清除自由基的活性显著增加。但木槿皮的挥发性化学成分及抑菌性的研究却鲜有报道。本文以无水乙醇为溶剂采用超声波辅助提取技术对木槿皮进行提取[17，18]，采用GC×GC-Q-TOFMS分析提取物的化学成分，并对其抑菌性进行研究，为木槿皮的进一步开发利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木槿皮：市售，北京同仁堂；大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌：以上菌种均由郑州轻工业大学微生物实验室提供。

1.2 仪器与设备

7200/7890B GC×GC-Q-TOFMS 美国安捷伦科技公司；SSM01固态调制器 上海雪景科技有限公司；KQ2200B型超声波提取装置 昆山市超声仪器有限公司；LA-230S型电子天平(感量0.001 g) 北京赛多利斯仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 木槿皮的提取

将干燥的木槿皮粉碎称重，放入500 mL三角瓶中，加入适量的无水乙醇，置于超声波提取装置中，选择在不同的液料比、粉碎度、提取温度、提取时间下萃取，萃取完成后取出三角瓶，抽滤，滤液在低温条件下旋蒸除去乙醇获得木槿皮提取物。

1.3.2 分析条件

1.3.2.1 GC×GC-TOFMS色谱条件

柱1：HP-5MS(Agilent Scientific，60 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱2：DB-17(Agilent Scientific，1.2 m×0.18 mm×0.25 μm)，两根色谱柱以串联方式连接，调制周期4 s。进样口温度280 ℃，载气He，载气流速1.5 mL/min。程序升温条件：起始温度50 ℃，保留5 min，以4 ℃/min升温到270 ℃，保留3 min，进样量1 μL，分流比100∶1，扫描频率50 Hz，扫描离子范围(m/z)：50～500 u。

1.3.2.2 质谱条件

四级杆温度：150 ℃；离子源温度(EI)：280 ℃；检测器电压：1700 V；电离能量：70 eV；传输线温度：230 ℃。

1.3.2.3 挥发性物质的定性分析

全二维数据处理采用Canvas公司的软件(Version 2.0)，自动识别信噪比大于30的峰，采用NIST 02质谱数据库鉴定各色谱峰的化学成分，采用面积归一化法测定各成分的相对含量。

1.3.3 抑菌性试验

称取25 g肉汤培养基、18 g琼脂，加入1000 mL蒸馏水，加热溶解后分装，于121 ℃高压灭菌15 min，备用。用于大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等的培养和抑菌试验。

采用倍比稀释法在96孔板中测定最小抑菌浓度(MIC)[19]。在MIC测定试验中，从无菌生长的液体培养基中取出20 mL涂布平板，继续培养(37 ℃/24 h)，观察有无菌落生长。无菌落生长的最小浓度即为最小杀菌浓度(MBC)。MIC试验中，为了保证提取物与培养液的互溶性，需在培养液中加入1%(V/V)的吐温80做乳化剂。

2 试验结果

2.1 液料比对提取率的影响

准确称取40目的木槿皮粉末10 g，分别按照液料比5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1的比例加入无水乙醇，在25 ℃的条件下超声萃取15 min，木槿皮的提取率见图1。

图1 液料比对产率的影响Fig.1 Effect of ratio of liquid to solid on yield of Hibiscus syriacus L.

由图1可知，木槿皮提取率随液体比例增大而提高，当液料比为12∶1时，木槿皮提取率最高，继续增加溶剂的量，提取效率略有降低，可能是因为溶剂过量会造成超声作用不完全，不能将所有的细胞壁震破，而导致提取率偏低。

2.2 粉碎度对提取率的影响

分别准确称取20，40，60，80，100目木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入无水乙醇，在25 ℃的条件下超声萃取15 min，木槿皮的提取率见图2。

图2 粉碎度对产率的影响Fig.2 Effect of crushing particle size on yield of Hibiscus syriacus L.

由图2可知，木槿皮的提取率随着粉碎度的增加呈上升趋势，这主要是由于粉碎度越大，萃取溶剂的接触面就越大，木槿皮中的有效成分就越容易被提取出来。

2.3 时间对提取率的影响

准确称取40目的木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入无水乙醇，在25 ℃的条件下分别超声萃取10，15，20，25，30 min，木槿皮的提取率见图3。

图3 时间对产率的影响Fig.3 Effect of time on yield of Hibiscus syriacus L.

由图3可知，木槿皮的提取率随着时间的延长呈上升趋势，当超声时间超过25 min后，木槿皮的提取率随超声时间的继续延长增加很少，这主要是由于木槿皮中的有效成分在25 min时基本都被提取出来。

2.4 温度对提取率的影响

准确称取40目的木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入无水乙醇，分别在20，25，30，35，40 ℃的条件下超声萃取15 min，木槿皮的提取率见图4。

图4 温度对产率的影响Fig.4 Effect of temperature on yield of Hibiscus syriacus L.

由图4可知，木槿皮的提取率随着温度的升高呈增加趋势，当超声温度超过35 ℃后，木槿皮的提取率随温度的升高反而降低，这可能是由于萃取温度逐渐上升，木槿皮中的一些低沸点成分易挥发，所以提取率略有下降。

2.5 正交试验

综合单因素试验结果，对影响超声波萃取的主要因素进行了四因素四水平试验，试验因素及水平见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 试验因素及水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table 2 The orthogonal experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由表2可知，影响因素大小顺序为：目数>提取时间>液料比>提取温度，最佳提取条件为：粉碎度100目，提取时间30 min，液料比15，提取温度40 ℃。

由表3可知，目数和提取时间为极显著影响因子，液料比为显著影响因子，提取温度为不显著影响因子。

2.6 挥发性成分分析

木槿皮提取物采用GC×GC-Q-TOFMS分析，所得全二维色谱图见图5，以计算机检索谱库确定化合物，以质谱离子峰面积百分数表示各成分含量，分析结果见表4。

图5 木槿皮提取物全二维色谱图Fig.5 The comprehensive two-dimensional chromatogram of Hibiscus syriacus L. extracts

表4 木槿皮提取物化学成分分析结果Table 4 The analysis results of chemical components of Hibiscus syriacus L. extracts

续 表

木槿皮提取物中共鉴定出41种挥发性成分，占总萃取物的63.78%，其中：酯类12种，酸类7种，烷烃类7种，醇类4种，酮类4种，酚类3种，醚类2种，醛类2种。含量较高的成分是一些酯类和酸类，如：己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亚油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸异丙酯(3.67%)。

2.7 抑菌性试验结果

木槿皮提取物以及青霉素钠对7种不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)以及最小杀菌浓度(MBC)测定结果见表5和表6。

表5 木槿皮提取物的最小抑菌浓度(MIC)Table 5 The minimum inhibitory concentration (MIC) of Hibiscus syriacus L. extracts μg/mL

表6 木槿皮提取物的最小杀菌浓度(MBC)Table 6 The minimum bactericidal concentration (MBC) of Hibiscus syriacus L. extracts μg/mL

由表5和表6可知，木槿皮提取物对7种细菌都具有一定的抑菌和杀菌能力，其中对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢杆菌的抑菌效果较好，对粪肠球菌和地衣芽孢杆菌的抑菌能力相对较差；木槿皮提取物对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢杆菌的杀菌效果相对较好，最小杀菌浓度(MBC)为500 μg/mL，对其他4种细菌的杀菌效果相对较差，最小杀菌浓度为1000 μg/mL。主要原因是木槿皮中含有的一些类黄酮、三萜类化合物和糖苷类化合物已被证实具有抗菌性，这些化合物易于被乙醇萃取出来，同时木槿皮提取物中含有的异丁香酚(0.19%)、丹皮酚(0.11%)和肉豆蔻醚(0.03%)也具有一定的抑菌作用。

3 讨论

挥发油是植物中重要的次级代谢产物，本研究从木槿皮提取物中共鉴定出41种挥发性成分，占总萃取物的63.78%，含量较高的成分是一些酯类和酸类如：己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亚油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸异丙酯(3.67%)。同一植物不同部位提取物的抑菌性存在一定的差异。金月亭采用40%的乙醇浸提木槿花，发现提取液质量浓度为100 mg干花/mL时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较为明显，质量浓度为125 mg干花/mL时，对枯草杆菌有一定的抑制作用，质量浓度为150 mg干花/mL时，对曲霉的抑制作用不太明显，在试验浓度范围内木槿花提取液对大肠杆菌、枯草杆菌、曲霉、金黄色葡萄球菌4种菌种未能完全抑制。Punasiya采用水、甲醇、石油醚、苯、氯仿对木槿叶进行了萃取，并研究每种萃取物对蜡状芽孢杆菌(MTCC-430)、表皮葡萄球菌(MTCC-435)、肺炎克雷伯氏菌(MTCC-432)和枯草芽孢杆菌(MTCC-121)的抗菌性。结果显示每种提取物都有一定的抗菌活性，但不同提取物的抗菌活性之间存在差异，甲醇提取物对4种细菌具有最好的抑制活性，其对蜡状芽孢杆菌(MTCC-430)、表皮葡萄球菌(MTCC-435)、肺炎克雷伯氏菌(MTCC-432)和枯草芽孢杆菌(MTCC-121)的最小抑菌浓度(MIC)分别为312，156，312，78 μg/mL。本研究发现木槿皮的乙醇提取物也具有较好的抗菌活性，其对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢杆菌和高地芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为306，470，544，246，271，654，276 μg/mL，对比发现：木槿花提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较好，木槿叶提取物对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑制作用较好，木槿皮提取物对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢杆菌的抑菌性较好；木槿皮提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果好于木槿花提取物，对肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果要好于木槿叶提取物，但对枯草芽孢杆菌的抑菌性要弱于木槿叶提取物。主要原因是植物的化学成分在不同的生长部位存在组成和含量的差异，而其抑菌性是多种成分共同作用的结果。

4 结论

木槿具有药用、食用、观赏兼备的价值，是一种很有开发前景的绿色经济植物，目前国内外对木槿的花和叶进行了大量的研究。本文以无水乙醇为溶剂，对木槿皮进行了超声波萃取，通过GC×GC-Q-TOFMS对提取物的挥发性成分进行了分析，共鉴定出41种挥发性成分，主要成分为己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亚油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸异丙酯(3.67%)；提取物对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌均有一定的抑制作用，本研究为木槿皮作为一种天然食品抑菌剂的进一步开发利用提供了一定的理论依据。