黄连解毒汤对脓毒症急性肺损伤大鼠炎症因子和氧化应激的影响

刘淑玲，蔡海荣，，陈燕虹，庄杰钦，蔡鑫桂，张为章，张烈元，陈伯钧

(1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120；2.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405)

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，SPF级，30只，体质量(190±10) g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK(粤)2013-0002]。饲养环境：温度18～28 ℃、相对湿度40%～70%，光照12 h，明暗交替。

1.2 药品、试剂和仪器 黄连解毒汤(黄连15 g，黄芩15 g，黄柏15 g，栀子15 g)，由广东省中医院药剂科提供。分别加6倍和4倍量的水煎煮2次，每次60 min，2次药液混合后置于100 ℃环境浓缩至原药材含量为1 g/mL。TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB酶联免疫(ELISA)试剂盒，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；MDA、SOD、XO、GSH-Px ELISA试剂盒，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MS-TS电子分析天平，购自梅特勒-托利多国际有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和模型构建 所有大鼠给予标准饲料适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组和黄连解毒汤组，每组各10只。采取盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and perforation，CLP)建立脓毒症急性肺损伤模型[5]：模型组和黄连解毒组大鼠用10%水合氯醛3 mL/(kg·bw)经腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定四肢，腹部备皮，常规消毒，沿腹正中线做2～3 cm的手术切口，逐层剖开腹部，寻找盲肠，在盲肠末端1.5 cm处结扎，然后用注射针头在盲肠远端扎穿2次形成盲肠漏，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁。假手术组大鼠切开腹部寻找盲肠后，不结扎，不穿刺，直接还纳腹腔。造模时间为24 h，造模过程中，假手术组大鼠全部存活，模型组和黄连解毒汤组各死亡1只。

1.3.2 给药方法 大鼠给药剂量按人与大鼠之间体表面积折算[6]等效剂量为4 g/(kg·bw·d)。造模24 h后，黄连解毒汤组给予用黄连解毒汤4 g/(kg·bw·d) 灌胃，模型组和假手术组给予等体积的生理盐水4 mL/(kg·bw·d)灌胃，1次/d，连续灌胃3 d。给药期间假手术组大鼠全部存活，模型组死亡2只，黄连解毒汤组死亡1只。

1.3.3 动脉血气检测 末次给药后所有大鼠禁食不禁饮12 h，用10%水合氯醛3 mL/(kg·bw)腹腔注射麻醉，打开腹腔，无菌肝素化注射器从腹主动脉取血10 mL行动脉血气分析。

1.3.4 ELISA法检测肺组织TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB、XO、GSH-Px、MDA、SOD 打开大鼠胸腔，取出双肺组织，右肺用生理盐水清洗干净后，匀浆机匀浆，15 000 r/min离心，取上清液，ELISA测定TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB、XO、GSH-Px、MDA、SOD。

1.3.5 肺组织湿/干重比(W/D)测定 取出左肺，用滤纸吸干左肺多余水分后称重(湿质量)，然后置于80 ℃烤箱内烘烤72 h，再次称重(干质量)，计算肺湿/干重比(W/D)。

1.3.6 统计学方法 运用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB检测 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，黄连解毒汤组大鼠肺组织TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠动脉血气检测结果Table 1 Levels of arterial blood gas test of rats in each group

表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB检测结果Table 2 Levels of TNF-α,IL-1,IL-6 and NF-κB in lung tissue of rats in each group

2.3 各组大鼠肺组织XO、GSH-Px、MDA、SOD检测结果 与假手术组比较，模型组肺组织GSH-Px、SOD水平明显降低(P<0.05)，XO、MDA水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，黄连解毒汤组大鼠肺组织GSH-Px、SOD水平明显升高(P<0.05)，XO、MDA水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肺组织XO、GSH-Px、MDA、SOD检测结果Table 3 Levels of XO,GSH-Px,MDA and SOD in lung tissue of rats in each group

2.4 各组大鼠肺组织W/D比 与假手术组比较，模型组肺组织W/D比明显升高(P<0.05)；与模型组比较，黄连解毒汤组肺组织W/D比明显降低(P<0.05)。见表4。

3 讨论

脓毒症已经成为影响人类健康的重要问题，随着创伤、烧伤、大手术等事件发生率升高，脓毒症的发生率呈现上升的趋势，具有高发病率、高死亡率等特点，不仅严重影响人类的生命健康，危及生命，而且造成严重的医疗负担。脓毒症常常引起多器官功能障碍，而肺组织是最长受累的器官，容易出现急性肺损伤和呼吸窘迫综合征。有研究表明，炎症反应和氧化应激反应在脓毒症急性肺损伤的发生、发展中起到重要的作用[4]。

表4 各组大鼠肺组织W/D比结果Table 4 Levels of W/D of lung tissue of rats in each group

细胞因子是炎症反应的重要组成部分，众多研究表明，在脓毒症急性肺损伤过程中，TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB等炎症因子起到重要的作用。NF-κB是一种真核细胞转录因子，参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡等过程。NF-κB是由5种亚基构成的同源或异源二聚体，p650是NK-κB是最重要的二聚体，当发生脓毒症时，受内毒素或炎症因子的影响，NF-κB发生泛素化降解，p650丧失了对NF-κB的束缚，NF-κB进入到细胞核中，与特定的靶基因序列结合，促进TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子分泌，进而引起炎症瀑布级联反应[7-8]。TNF-α是炎症反应的起始触发因子，可以激活中性粒细胞和单核巨噬细胞分泌IL-1、IL-6等二级炎症因子，也可以反过来激活NF-κB，形成恶性循环。NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子在肺组织聚集，直接损伤肺泡上皮细胞，导致肺泡表面活性物质分泌减少，引起肺泡塌陷；也可以引起肺毛细血管通透性增加，导致肺水肿，表现为肺通气/血流比例失调，肺容积减少，最后进展为肺纤维化[9]。氧化应激在导致脓毒症急性肺损伤过程中同样起到重要的作用。氧化应激产生的自由基可以直接破坏蛋白质结构，引起蛋白质活性改变；促进肺组织分泌血管活性物，导致肺毛细血管扩张，促进血管内物质渗透至肺泡或肺间质，引起肺水肿；抑制肺泡表面活性物质的合成，导致肺泡塌陷，最终引起急性肺损伤[10]。XO是核苷酸的代谢产物，当机体内XO增加时，提示氧自由基增多，氧化损伤更严重[11]。MDA可以反映氧自由基的活性和数量，提示细胞损伤的程度[12]。SOD是重要的抗氧化物质，具有抑制氧化应激反应，保护肺组织的作用[13]。GSH-Px是氧自由基清除酶，可以保护肺组织，防止肺细胞免受脂质过氧化的损伤[14]。炎症因子可以激活氧化应激，氧化应激可以促进炎症因子释放，二者形成恶性循环，导致肺损伤[15]。

综上所述，黄连解毒汤具有减轻肺水肿、改善肺通气、抑制炎症因子和氧化应激的作用。