外源酶对夏秋红茶主要品质成分影响研究

林剑峰，白建阳，吴理文 ，张海华

（1.松阳县科学技术局，浙江松阳 323400；2.松阳县建阳茶叶有限公司，浙江松阳 323400；3.浙江正德和食品有限公司，浙江松阳 323400；4.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016）

茶叶是我国重要的农产品，近十年，我国茶产业规模（产量、面积、农业产值）稳居世界首位，茶叶产量从134 万吨增长至279 万吨， 茶园面积从186 万公顷增长至306 万公顷， 农业产值从413亿元增长至2396 亿元[1-2]，发展势头良好。 另一方面， 茶资源供过于求的差距不断增大， 主要表现在：干毛茶供过于求差额达30 余万吨，占比50%以上的夏秋茶的利用率低、弃采严重，加之茶园荒弃等现象时有发生，导致茶叶、茶花、茶籽（果）、茶枝条等能用却未用资源总量逾400 万吨。 中国茶产业总体表现出茶资源供过于求的差距不断增大的趋势、质量效益亟待提高的突出瓶颈[3-5]。 基于此， 文章着重开展外源酶对以夏秋茶鲜叶为原料加工的红茶的品质影响研究，旨在探索利用闲置、弃采夏秋茶资源， 希望通过外源酶调控小叶种红茶品质。

以小叶种茶树鲜叶为原料加工制作红茶的工艺及产品已相当成熟，如浙江杭州市的九曲红梅、观音红等[6-8]。现有这类产品多采用春季茶鲜叶，而对小叶种茶树的夏秋季鲜叶加工制作红茶的加工技术和产品尚显不足。少量研究报道表明，外源添加食品酶制剂能够改善茶叶加工或深加工的效果。目前相关研究主要集中在两方面：一是将外源酶用于茶叶深加工（速溶茶、茶饮料）的前处理，主要有单宁酶、纤维素酶、蛋白酶和果胶酶，能够增加浸出物含量，提高速溶茶的冷溶性，进而改善速溶茶或茶饮料的品质[9-11]；二是将外源酶用于红茶加工中，在发酵时添加外源酶（单宁酶、纤维素酶和多酚氧化酶），能够缩短发酵时间，改善红茶品质，如苏祝成等[12]利用外源单宁酶改善了夏茶滋味品质成分和组成、包先进等[13]在砖茶加工中加入纤维素酶对微生物发酵进行部分替代而促进了砖茶品质的形成。文章突破前人研究思路，以小叶种茶树夏秋鲜叶为原料， 探索在红茶揉捻工序加入外源酶， 研究外源酶对红茶主要内质成分的影响，为红茶品质研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为2016 年9 月采自浙江松阳县赤寿乡娄塘村茶园白叶1 号茶树品种一芽一二叶。

纤维素酶（EC3.2.1.4，20000 U/mL）：诺维信生物技术有限公司 （中国上海）； 木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2，50000 U/g）：广西南宁东恒华道生物科技有限公司；单宁酶（EC 3.1.1.20，500 U/g）：江西百盈生物科技有限公司。儿茶素标品：上海源叶生物科技有限公司；茶黄素标品：Sigma-Aldrich 有限公司；乙腈（色谱纯）、蒽酮、乙醇等化学分析试剂：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

YF-6CWD-6 型红茶萎凋槽： 安溪县永锋机械有限公司；6CSW-100 摇青机、6CR-35 茶叶揉捻机：浙江上洋机械有限公司；干燥箱：上海印溪仪器仪表有限公司。 ME4001 型电子天平： 梅特勒-托利仪器有限公司；DK-S26 型电热恒温水浴锅、HG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；1525 型高效液相色谱仪：美国 Waters 公 司 ；5424R 型 高 速 离 心 机 ： 德 国Eppendorf 公司；UV-2102PC 型紫外分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；LRH-70 型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 加工实验方法

红茶加工技术路线为萎凋、揉捻、发酵、干燥、提香，在揉捻过程中加入食品酶制剂。

加工流程为将当日采摘的夏秋鲜叶均匀摊放于萎凋槽中，摊叶厚度15 cm，环境温度30 ℃、环境湿度80%～86%下自然萎凋21 h，获得适宜揉捻的萎凋叶。 取等量2 kg 萎凋叶进行揉捻和发酵试验， 设置揉捻和发酵实验条件为环境温度25 ℃、环境湿度88%，轻压揉捻（20 min）→中压揉捻（60 min）→发酵（28 ℃，8 h）。 酶制剂添加量实验安排见表1。 干燥和提香参数根据实际生产经验，确定干燥参数先 110 ℃、55 min， 再 70 ℃、120 min，提香参数 120 ℃、35 min。

表1 外源酶应用实验安排Table 1 Test design of the addition of exogenous enzymes

1.4 红茶品质分析方法

对红茶样品进行品质成分分析， 主要分析水浸出物、茶多酚、可溶性糖、咖啡碱、儿茶素、茶黄素、茶氨酸的含量，以此探讨外源酶对红茶内质成分的影响。 含水率的测定参照GB/T 8304—2013《茶 水分测定》； 水浸出物的测定参照 GB/T 8305—2013《茶 水浸出物含量测定》；咖啡碱含量的测定参照GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》；茶多酚和儿茶素含量测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；茶氨酸含量测定参照GB/T 23193—2017《茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法》；茶黄素含量测定参照GB/T 30483—2013 《茶叶中茶黄素的测定高效液相色谱法》； 可溶性糖测定采用蒽酮-硫酸比色法[14]。

1.5 数据分析

数据处理和图表绘制采用WPS OFFICE EXCEL 2007。 每个实验重复3 次，最终数据取平均值表示。

2 结果与分析

2.1 水浸出物含量

从图1 可以看出， 加酶样品的水浸出物含量均高于对照样， 说明加酶能够增加茶叶的水浸出物含量， 以及酶将茶叶中水不溶性组分经酶解作用实现部分可溶。 对样品进行排序：对照＜单宁酶01#＜单宁酶02#＜单宁酶03#＜蛋白酶03#＜蛋白酶01#＜蛋白酶+单宁酶＜纤维素酶01#＜蛋白酶02#＜纤维素酶02#＜纤维素酶03#＜蛋白酶+纤维酶＜三种酶混合＜单宁酶+纤维酶。从排序结果来看，就三种酶单独使用而言， 纤维素酶对于红茶水浸出物含量的增加效果最好，其次是蛋白酶，最后是单宁酶，这与三种酶的自身特性和底物含量有关；就两两组合酶来说，单宁酶+纤维素酶最好，其次是蛋白酶+纤维素酶，最后是蛋白酶+单宁酶，且所测值高于单酶，说明双酶间有协同增效作用。当三种酶同时应用时，其效果并未特别突出，与蛋白酶+纤维素酶、单宁酶+纤维素酶、纤维素03#相当。

图1 红茶样水浸出物含量Fig.1 Water extract content of black tea samples

2.2 可溶性糖含量

从图2 可知， 加酶可以显著增加红茶中可溶性糖含量， 增加幅度最低者蛋白酶02# 增加了59%， 增加幅度最高者纤维素酶 01# 增加了193%，这一结果从内质上支撑了红茶滋味甜度的提高。对比加酶样品，纤维素酶参与的样品可溶性糖含量高，其次是单宁酶，最后是蛋白酶。 从双酶样品结果可知蛋白酶和单宁酶组合具有协同增效作用，而与纤维素酶组合呈降效作用。

2.3 多酚总量

多酚是茶叶中非常重要的品质成分， 是多酚氧化酶作用的底物， 其氧化产物是红茶中重要的内质成分茶红素、茶黄素等。 如图2 所示，实验样品的多酚总量主要介于11.12～17.46 g/100 g。与对照样相比，除单宁酶01# 外，其余加酶样品中多酚总量都高于对照样。结合双酶结果推断，就单酶使用而言蛋白酶对于增加多酚总量作用最大， 就双酶使用而言蛋白酶和纤维素酶具有协同增效作用。

2.4 咖啡碱含量

如图2， 加酶后样品中咖啡碱含量与对照相当，分布在4.64～5.70 g/100 g 之间，说明加酶对红茶中咖啡碱的含量影响不大， 进一步推测茶叶中咖啡碱的存在受水不溶蛋白和纤维素等大分子影响较小， 或是与蛋白或纤维素之间结合态少的缘故。

图2 红茶样茶多酚、可溶性糖和咖啡碱含量Fig.2 Content of tea polyphenols, suluble sugar and caffeine in black tea samples

2.5 茶氨酸含量

红茶样品中的茶氨酸含量分布在0.35～0.60 g/100 g 之间，加酶后样品中纤维素酶01# 与对照相当，其余样品茶氨酸含量均低于对照，且酶用量最大者降幅也最大，见图3。 可能是因为酶解作用打破了茶叶细胞系统中物质间固有的平衡， 使得L-茶氨酸暴露或游离出来，光照下引起不稳定[15]。

2.6 茶黄素含量

茶黄素由多酚类及其衍生物氧化缩合而来，主要是由儿茶素中的 （-） 表没食子儿茶素 （LEGC） 与 （-） 表没食子儿茶素没食子酸酯 （LEGCG） 缩合而成，TF-3-G （茶黄素-3-没食子酸酯）、TF-3'-G（茶黄素-3'-没食子酸酯）、TFDG（茶黄素-3,3-双没食子酸酯）和TF（茶黄素）是常见的可检测的茶黄素单体。 红茶中茶黄素类的含量一般为0.3%～1.5%，对红茶品质起着决定性作用。所有实验样中（图4），以单宁酶+纤维素酶样品的茶黄素总量最高为1.54 g/100 g，以单宁酶01# 最低0.53 g/100 g。 实验样品的茶黄素含量排序为：单宁酶 01#＜单宁酶 02#＜蛋白酶 02#＜蛋白酶01#＜单宁酶03#＜对照＜蛋白酶+单宁酶＜蛋白酶03#＜三种酶混合＜纤维素酶03#＜纤维素酶01#＜纤维素酶02#＜蛋白酶+纤维酶＜单宁酶+纤维酶。三种酶中纤维素酶对茶黄素具有增效作用， 单宁酶作用后茶黄素含量比对照低。 无论是蛋白酶还是单宁酶与纤维素组合，都表现出增效作用。

2.7 儿茶素含量

儿茶素是茶鲜叶中的特征性成分， 红茶发酵工序将儿茶素通过非微生物作用的聚合、氧化、异构化等反应转化为茶黄素或茶红素等。 图5，加酶后儿茶素总量都提高了60%以上， 加酶样品中儿茶素总量最高者为单宁酶01# 和单宁酶+纤维素酶、最低者为三种酶混合样品。 就单酶而言，从提高程度上排序为纤维素酶＞蛋白酶＞单宁酶。 无论蛋白酶还是单宁酶与纤维素酶组合使用， 提高幅度均不及纤维素酶或蛋白酶单独使用。

图3 红茶样茶氨酸含量Fig. 3 Content of theanine in black tea samples

图4 红茶样中茶黄素含量Fig.4 Content of theaflavins in black tea samples

3 讨论

纵观上述红茶的水浸出物、 茶多酚、 可溶性糖、咖啡碱、儿茶素、茶黄素、茶氨酸含量7 个主要品质指标的变化，结合表2 木瓜蛋白酶、纤维素酶和单宁酶的作用机理和应用效果分析：（1）单宁酶通过水解多酚类化合物中酯键和缩酚酸键实现对茶叶中茶多酚、儿茶素总量及单体、茶黄素总量及单体的动态调控。 研究认为单宁酶能够增加茶梗提取液中儿茶素的总量[16]，且公认单宁酶能够转溶“茶乳酪”（多酚类、咖啡碱、蛋白质等物质通过分子间氢键与疏水作用络合而成），即通过水解切断儿茶素复合物中的酯键， 解离出的没食子酸又能与茶红素、茶黄素竞争咖啡碱，形成分子量较小的水溶物，从而降低茶汤浑浊度[17]，FUKUDA 等[18]研究也认为单宁酶处理绿茶提取物能够提高非聚合型儿茶素类浓度。综合分析，认为在茶叶加工中使用单宁酶一方面可降解儿茶素复合体 （天然结合态茶多酚，加工中形成的茶乳酪等），另一方面对于儿茶素缩合产物的生成亦有一定影响。 夏秋鲜叶中因多酚、氨基酸等滋味物质比例不协调，常出现苦涩味， 而单宁酶通过水解作用可动态调控多酚类（茶多酚、儿茶素、茶黄素）的转化，进而改变呈味物质的比例[19]。 （2）蛋白酶主要是对茶叶中的蛋白质进行水解作用， 茶叶中蛋白质含量一般在20%左右且多是水不溶蛋白， 蛋白酶对茶叶蛋白进行水解，产生肽段和部分氨基酸，增加了红茶的水浸出物含量，同时释放了多酚-蛋白复合物中的多酚类物质[20]，进而增加了红茶中多酚类物质的含量，前人研究也发现在红碎茶加工、红茶发酵中添加蛋白酶， 均能够增加茶黄素和氨基酸的含量，且此时多酚氧化酶活性可提高一倍，有效缩短发酵时间[21-23]。同时蛋白酶水解产生的肽段及氨基酸类具有呈味作用[24]，从而能够改变红茶的呈味物质组成及比例，最终影响红茶茶汤的滋味。 （3）纤维素酶能够水解茶叶细胞壁物质，更快、更多的释放细胞质， 这为茶叶中固有的多酚氧化酶提供了更多的底物和酶促机会， 因此表现出添加纤维素酶的红茶的多项品质指标都有增高现象。

图5 红茶样中儿茶素含量Fig.5 Content of catechins in black tea samples

表2 外源酶在茶叶加工中的作用机理[25]Table 2 Mechanism of exogenous enzymes in tea processing[25]

总体而言， 添加蛋白酶对于红茶主要内质成分的增加具有较好的作用， 因此蛋白酶可优选为红茶加工用外源酶。纤维素酶，对于红茶内质也有增加作用， 但是鉴于纤维素酶对细胞壁的水解作用，实验中肉眼可见易出现叶张不完整、外形和叶底不匀、茶汤有叶渣等现象，这对纤维素酶的实际应用有所影响。