髓样分化因子88对姜黄素诱导肝星状细胞凋亡的影响分析

广州市红十字会医院（510240）童巧勤

肝脏纤维化是肝脏自身对一系列慢性刺激作出的自我修复反应，目前已知肝脏纤维化的中心环节是肝星状细胞的增殖与活化[1]。现有研究表明，姜黄素促进肝脏星状细胞的凋亡从而起到抗肝纤维化的目的，其主要可能机制是姜黄素能够抑制星状细胞Ⅰ型胶原蛋白α1的表达以及其他一系列的信号通路的改变，其中较为重要的是髓样分化因子88（MyD88）依赖性信号通路，而MyD88是该信号通路中的一项重要蛋白[2]。而MyD88是否在姜黄素抑制星状细胞的凋亡过程中起到一定作用，目前尚未可知，本研究即探究MyD88对姜黄素抑制星状细胞的凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 基本资料 本次研究所用到的主要试剂与材料有肝星状细胞株HSC-T6、姜黄素、MyD88 siRNA、特级新生小牛血清、胰蛋白酶、MyD88抗体、一抗二抗剥脱液等。其来源统计如附表1。

1.2 方法 细胞培养：采用大鼠肝星状细胞株HSC-T6，细胞株培养在含 100 U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液中。细胞培养箱条件为37℃，含有5%CO2。以下所有实验用细胞均取对数生长期细胞。

细胞传代：待培养瓶中的细胞生长至约90%融合时，进行细胞传代。从培养箱中取出培养瓶，倒掉培养液后，向瓶内加入1ml消化液（0.25%胰蛋白酶）轻轻摇动培养瓶，然后倒掉消化液，再加入1ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。消化2～5分钟后把培养瓶置于倒置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含血清的培养液终止消化。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之成为单细胞悬液。将得到的细胞悬液分瓶培养。按照1∶2比例传代。

MyD88及姜黄素处理：将培养的HSC-T6细胞分为对照组、MyD88组、姜黄素组、MyD88+姜黄素组，采用MyD88 siRNA对MyD88组、MyD88+姜黄素组进行干扰，48h后再加入姜黄素进行干扰24h。

1.3 指标检查方法 Western印迹检测蛋白表达：采用胰酶消化离心生长至对数期的HSC-T6细胞细胞，并加入细胞裂解液，反复吹打细胞混液使裂解液充分作用，30min后对其进行离心取上清液，Bradford法对上清液进行蛋白定量处理，取上清液0.05ml与0.1mlSDS混匀后再加入4倍体积的PBS溶液，加热至沸腾变性；将变性蛋白进行凝胶电泳处理后用5%脱脂奶粉封闭转好的PVDF膜1h，加入已孵育好的一抗，过夜，洗膜，加入二抗后孵育120min，显影，最后用Quantity One4.6.2软件分析目的条带的灰度值。以目的蛋白条带灰度值与相应的GAPDH条带灰度值的比值，作为目的蛋白的相对量，用于统计学分析。将每小组3个样本的对应结果计算后，取平均值。

流式细胞术检测细胞凋亡：取相同量的细胞混悬液，离心5min（1200r/min）后弃上清液，向各组中分别加入200μl的PBS溶液并轻轻混匀，然后依次加入AnnexinV-FITC染液和碘化丙啶(PI)各2μl，混匀后于37摄氏度温箱内孵育15min，结束后加入200μl的PBS溶液上流式细胞仪进行检测。

1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS19.0分析，计量资料采用t值检验，计数比较卡方x2检验，检验标准α=0.05，当P<0.05表示有统计学意义。

附表1 实验材料及来源统计表

附表2 四组细胞的MyD88表达水平对比

附表3 四组细胞的凋亡率对比

2 结果

2.1 四组细胞之间的MyD88表达水平MyD88组灰度比值为（0.472±0.022），姜黄素组灰度比值为（0.585±0.037），M y D 8 8+姜黄素组灰度比值为（0.184±0.039）、对照组灰度比值为（0.968±0.085），四组之间的统计学比较见附表2。

2.2 四组细胞凋亡率比较 MyD88组凋亡率为（8.389±1.131），姜黄凋亡率为（27.185±6.032），MyD88+姜黄素组凋亡率为（40.286±10.029）、对照组灰度比值为（7.927±1.025），四组之间的统计学比较见附表3。

3 讨论

肝星状细胞是肝纤维化过程中的关键细胞，而姜黄素具有良好的抗肝纤维化作用，目前对其作用机制的认识尚处于理论阶段，主要认为与以下几点关系密切：①姜黄素能降低多种胶原（Ⅰ～Ⅳ型）的表达同时能促进这些胶原的降解；②姜黄素可以抑制TIMP-1的表达，该因子的主要作用是促肝纤维化细胞因子的表达；③姜黄素能促进肝星状细胞的凋亡[3][4]。其中促进肝星状细胞的凋亡是其发挥主要可能机制是姜黄素能够抑制星状细胞Ⅰ型胶原蛋白α1的表达以及其他一系列的信号通路的改变，Toll样受体通路（TLR）占主要作用。目前主要认为TLR激活后能够导致NF-κB活化，而在TLR活化NF-κB的过程中，最主要的作用物质是MyD88。本研究即从此出发探究MyD88对姜黄素促进肝星状细胞凋亡效果的影响。

结果发现，采用MyD88 siRNA、姜黄素、MyD88+姜黄素对星状细胞进行干扰后，细胞的MyD88表达水平均降低，同时MyD88 siRNA、姜黄素单独应用时均不如MyD88+姜黄素的抑制作用强；而在对星状细胞凋亡的影响作用上，姜黄素组、MyD88+姜黄素组的细胞明显凋亡（P<0.05），而MyD88组未出现明显凋亡（P>0.05），姜黄素组、MyD88+姜黄素组比较，MyD88+姜黄素组的凋亡率更高（P<0.05）。

总之，在肝星状细胞降低MyD88的表达有助于提高姜黄素对其凋亡的促进作用。