东北当归属植物DNA条形码分子鉴定研究

2020-10-21张露云车环宇于俊林张立秋夏广清

人参研究 2020年5期

张露云，车环宇，于俊林，张立秋，夏广清*，臧皓*

（通化师范学院医药学院·吉林通化·134002）

中药鉴定是中医药研究的重要基础课题，其宗旨是解决中药材“真伪优劣”的关键问题，传统的性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等中药鉴定方法存在主观性强、稳定性和重复性差等方面的弱点。DNA条形码是运用基因组中公认的一段DNA片段进行物种鉴定的分子诊断技术[1]。DNA分子标记是以生物间核苷酸差异为根本的标记技术，是在DNA水平上对遗传物质差异的反应，能够更精准的揭示种间、种类的差异，且不受环境、发育阶段的影响，多态性强、数量丰富、分布广泛均匀，近年来此技术已得到普遍关注，并成为生物鉴定与分类研究的热门[2-3]。DNA条形码用以中药分子鉴定的新技术、可以敏捷、精确地鉴定物种，待测的样品只需要经过DNA提取、PCR扩增、电泳检测、基因测序和数据库比对，便可确定物种，能便利地进行种间区分[4-5]。

本实验通过对东北地区6种当归属物种采用4种DNA条形码序列（IST2、叶 matK、rbcL和trnH-psbA)进行系统地评估，对比不同序列间PCR扩增、测序成功率及不同片段的物种鉴别率等，目的是筛选得到适用于鉴定多种当归属物种的DNA条形码，为东北产当归属植物鉴别提供了重要参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

收集长白山区分布的当归属全部6个物种，每个物种采集3个样本，样品表及序列登录号见表1。此外，从GenBank上下载尖叶藁本Ligusticumacum inatum，滨海前胡 Peucedanum japonicum，泰山前胡Peucedanum.wawrae 3个物种8个样品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH序列作为外类群，通过解析Gen-Bank的.gb 文件确保同一组 ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH序列均来自于相同的Voucher number，即同1个样品，从而确保序列对齐。DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co)，2×PCR mix(Aidlab Biotechnologies Co)。

表1 样本及序列登录号

表2 从GenBank下载的外类群序列

1.2 仪器

球磨仪(德国Retsch公司MM400型)；高速离心机(德国sigma公司1-14型)；超微量分光光度计(美国Thermo公司NanoDropOne型)；电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司SQP型)；聚合酶链式反应(PCR)扩增仪（T100型)；电泳仪(北京六一生物科技有限公司DYY-6C型)；测序仪(美国Applied Biosystems公司ABI3730XL型)；凝胶成像仪 (美国 Bio-Rad公司GhemiDoc TM XRS+型)。

2 实验方法

2.1 DNA提取及浓度测定

根据文献[6-8]中报道的方法取硅胶干燥的叶片样本 10～20 mg，球磨仪研磨 2 min(每秒 30 次)，随后应用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并测定OD值及A260/A280比值。另取一不含样品的空管，依照上法操作以排除实验室中可能得环境污染对实验结果的影响。

2.2 PCR扩增、克隆及测序

根据文献[9-11]中报道的方法扩增了ITS2、matK、rbcL和psbA-trnH序列，引物和扩增步骤如表3所示。取 PCR 反应体系 25 μL，2×PCR mix 12.5 μL，2.5 mM正向和反向引物各1μL，模板DNA 2 μL，滴加无菌双蒸水至25 μL，将无模板DNA的PCR反应设为阴性对照。使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。使用测序仪对纯化扩增的产物进行双向测序。

表3 引物序列和扩增条件

2.3 数据分析

使用CondonCode Aligner V 9.0.1(CodonCode Co.,USA)软件进行序列的比对、拼接并去除引物区域。使用隐马尔可夫模型 (Hidden Markov Model,HMM)除去ITS2序列的5.8S rRNA和28S rRNA基因区，基于同源序列比对去除psbA-trnH序列的psbA基因序列和trnH序列，rbcL和matK去除引物后直接进行分析。MEGAX软件用于多序列比对和构建NJ(Neighbor-Joining)系统发育树，应用Bootstrap检验各分支的支持率(重复1000次)。利用PAUP 4.0软件进行遗传距离计算，采用自己编写的Python程序进行DNA条形码GAP分析。基于BLAST和Tree-Building方法进行物种鉴定。

3 实验结果

3.1 DNA提取、PCR扩增及测序结果

DNA提取结果表明，长白山当归属的硅胶干燥叶片非常容易获取高质量的DNA，取样10～20 mg、水浴40 min所获得DNA的平均OD值为190.0 ng/μL，A260/A280的值均处于1.8～2.0之间，详见表4。所有样品均可成功地进行ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL序列的扩增。PCR扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图中psbA-trnH、ITS2、rbcL和matK序列的条带大小约为300、500、750和900 bp。所有PCR产物均成功测序，其中ITS2序列可以得到高质量的双向测序峰图，psbA-trnH序列存在两处Ploy结构，但是其不影响测序峰图的质量，由于rbcL和matK序列片段较大，测序峰图的两端质量较差，需要进行人工矫正。

表4 样品DNA的质量

3.2 种间种内遗传距离和DNA条形码GAP分析

从种间变异来看，ITS2序列的种间距离最大，为0.0447，rbcL序列的种间距离最小，为0.0005，两者相差近90倍；ITS2序列的种间最小距离最大，为0.0346，但其种内最大距离仅为0.0015，两者相差约23倍，ITS2的种间最小距离显著大于种内最大距离；对于种内距离，只有psbA-trnH序列的种内距离较大，这主要是因为长鞘当归的样品间存在6 bp的Inversion区域，样品HSPS3104和HSPS3106的序列为“TTCTAT”，而样品 HSPS3105 为“ATAGAA”，造成对种内距离的高估。种内与种间距离的分析结果详见表5。从DNA条形码GAP分析来看，所有物种的ITS2和matK序列均存在DNA条形码GAP，ITS2比matK序列的DNA条形码GAP更明显，说明物种的界限较清晰；3个物种的psbA-trnH序列存在DNA条形码GAP；仅有1个物种的rbcL序列存在DNA条形码GAP。

表5 种间种内变异分析

3.3 基于BLAST和系统发育树的物种鉴定分析

基于BLAST方法，采用在数据库中去除自身序列的策略，实验结果见图1。ITS2和matK序列在样品水平和物种水平的物种鉴定效率均为100%，表明所有物种和样品均可以被鉴定。psbA-trnH序列在样品水平和物种水平的物种鉴定效率分别为61.11%和50%，物种水平和样品水平的物种鉴定效率不一致的原因为长鞘当归的样品HSPS3105的Inversion方向，与样品HSPS3104和HSPS3106的Inversion方向不同，导致HSPS3105样品鉴定失败。rbcL序列的物种鉴定能力仅为16.67%，是最低的。图2-5所示的分析结果表明，在以ITS2和matK序列构建的NJ系统发育树中，6个物种均可聚为独立的分枝，这可以清晰的相互区分，ITS2序列构建的NJ系统发育树的枝长差异更明显；基于psbA-trnH序列，长鞘当归分为两个枝，朝鲜当归与黑水当归聚为一个枝，无法区分；对于rbcL序列，仅有拐芹聚为一个独立的枝，可以与其他物种相互区分，其余5个物种相互交叉，无法区分。

图1 基于BLAST方法的物种鉴定效率分析

图2 基于ITS2序列构建的NJ系统发育树，Bootstrap值为2000.

图3 基于psbA-trnH序列构建的NJ系统发育树，Bootstrap值为2000.

图4 基于rbcL序列构建的NJ系统发育树，Bootstrap值为2000.

图5 基于matK序列构建的NJ系统发育树，Bootstrap值为2000.

4 讨论

ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH 序列为药用植物鉴定中的常用序列，本实验选取这4个序列进行DNA条形码研究，所有样品均能成功进行序列的扩增。总体来看，matK序列引物的通用性较差，rbcL序列的物种鉴定效率较低，psbA-trnH序列的重复结构较多，测序成功率较低，而ITS2序列的鉴定成功率高达100%。从系统发育树可知，6种植物各自聚为一支，可以很好地区分开。以上结果表明，ITS2序列能很好地对当归属植物进行鉴别。

本研究首次应用DNA条形码技术对东北当归属植物进行系统鉴定，研究结果证明ITS2序列能够快速、准确、有效鉴定上述植物，方法操作简便，易于掌握。基于ITS2序列的DNA条形码技术在当归属植物鉴定中的应用有效地保障了种质资源鉴别的真实性，具有较大潜力。