人参果皂苷联合九里香叶总黄酮对大鼠糖尿病性心肌病的保护作用

孙 皎，于晓风，付雯雯，李 敏，徐华丽，睢大筼*

（1.吉林大学药学院药理教研室，长春130021；2.吉林大学护理学院，长春130031）

人参果皂苷（GFS）系从五加科人参属植物人参（Panax ginseng C.A.Mey）的成熟果实中分得的人参皂苷类物质，主要成分人参皂苷Re的含量达85%。课题组前期研究表明，GFS对大鼠急性心肌缺血、心肌梗死及其心肌缺血再灌注损伤均具有明显保护作用[1～3]，能明显降低心肌梗死犬的心肌缺血程度及缺血范围，缩小心肌梗死面积，降低血清心肌三酶活性，能改善心肌代谢，提高内源性抗氧化酶活性，减轻氧自由基的损伤，亦可使急性心肌梗死犬心肌血流量明显增加，冠脉血管阻力降低，心肌氧利用率及心肌耗氧量明显减少[4～6]，并对四氧嘧啶及肾上腺素所致的实验性高血糖均具有明显降糖作用，可能与其清除自由基、抑制脂质过氧化及增加葡萄糖的转化和利用有关[7]。

九里香叶总黄酮（TFMP）是从芸香科九里香属植物九里香（Murraya paniculata(L.)Jack）叶中提取出的黄酮类化合物，总黄酮含量达到92%以上。2009年，治疗Ⅱ型糖尿病中药5类新药 《九里香叶总黄酮胶囊》临床前研究，获得国家“十一五重大新药创制”科技重大专项立项资助（2009ZX09102-102），已完成全部临床前研究工作，并顺利通过国家验收。研究表明，TFMP对肾上腺素所致小鼠实验性高血糖以及大鼠2型糖尿病均具有明显保护作用，能提高胰岛β细胞分泌指数，改善脂代谢紊乱，抵抗自由基介导的脂质过氧化，减轻炎性反应[8]，并对大鼠实验性糖尿病肾病和心肌病具有保护作用[9、10]。本文建立大鼠糖尿病性心肌病模型，观察二者联合应用的协同作用，为其开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 动物

Wistar大鼠，雄性，体重 160～180g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，质量合格证号：SCXK-（吉）2007-0003。

1.2 药品及试剂

GFS由吉林省集安益盛药业股份有限公司提供，批号：20180825，TFMP由长春瑞德医药科技有限公司提供，批号：20180810，均以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成所需浓度；卡托普利由上海普康药业有限公司生产，批号：20180603；链脲佐菌素美国Sigma 化学公司，批号：087k1403；CK-MB、LDH、AST、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α 及 IL-1β 测试盒由南京建成生物工程研究所提供，批号：20180915；TC、TG、LDL-c及HDL-c测试盒由浙江东瓯诊断产品有限公司提供，批号：20180910。

1.3 实验方法

160只 Wistar大鼠随机分为正常组（20只）和造模组 （140只）。造模组大鼠每日给予高糖高脂饮食（配方：20%蔗糖，10%猪油，10%鸡蛋，1%胆固醇，0.1%胆酸钠，0.2%丙硫氧嘧啶，正常大鼠饲料），正常组大鼠每日正常饮食、水。8周后，正常组和造模型组随机各取10只大鼠，尾静脉取血检测血清TG、TC及FFA含量，确证造模组大鼠产生胰岛素抵抗后，舌下注射STZ（30mg/kg），正常组舌下注射等体积缓冲液。2周后，尾静脉取血用血糖仪检测空腹血糖，将空腹血糖值 （FBG）≥11.1mmol/L大鼠列入2型糖尿病动物。将成模大鼠按血糖和体重随机分为5组，即：模型组、GFS（80mg/kg）组、TFMP（80mg/kg）组、联合用药（GFS 40mg/kg+TFMP 40mg/kg）组及阳性药卡托普利（10mg/kg）组，每组20只。另选10只正常组大鼠作为对照组。各组大鼠按照上述剂量每日灌胃给药1次，正常组及模型组灌胃给予0.5%CMC-Na 10mL/kg，连续12周。每周记录体重，每3周尾静脉取血，用血糖仪测定FBG一次。实验结束时，腹腔注射10%水合氯醛30mg/kg麻醉，腹主动脉采血，离心分离血清，测定 CK-MB、LDH、AST 活性及 GSP、TC、TG、HDL-c及LDL-c含量，并通过TC/HDL-c计算冠状动脉风险指数（CRI）。取大鼠心肌组织，在4℃环境下制备组织匀浆，3500r/min离心15min后吸取上清液，用试剂盒检测心脏组织 SOD、GSH-Px活性及 MDA、TNF-α、IL-1β含量。

1.4 统计处理与数据分析

数据采用±s表示。应用SPSS13.0统计软件包进行t检验统计学处理。

2 结果

2.1 对糖尿病性心肌病大鼠血清心肌三酶活性的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清CK-MB、AST和LDH活性均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，GFS、TFMP、联合用药及卡托普利组均可使血清CK-MB、AST 和 LDH 活性明显降低（P＜0.05或 P＜0.01），详见表1。

表1 联合用药对糖尿病性心肌病大鼠血清心肌三酶活性的影响（）

表1 联合用药对糖尿病性心肌病大鼠血清心肌三酶活性的影响（）

与对照组比较 ##P＜0.01；与模型组比较 *P＜0.05，**P＜0.01

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2.2 对糖尿病性心肌病大鼠血糖的影响

与对照组比较， 模型组大鼠第 0、3、6、9、12 周FBG 均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，GFS、TFMP及联合用药组于药后第3周FBG均显著降低 （P＜0.05或 P＜0.01），并持续到12周；卡托普利组FBG无明显差异（P＞0.05），详见表 2。

表2 联合用药对糖尿病性心肌病大鼠血糖的影响（x±s）

2.3 对糖尿病性心肌病大鼠血脂的影响

与对照组比较，模型组大鼠TG、TC及LDL-c含量及CRI均显著升高，HDL-c含量显著降低 （P＜0.05或 P＜0.01）。与模型组比较，GFS、TFMP及联合用药组可使TG、TC及LDL-c含量及CRI显著降低，HDL-c含量显著升高 （P＜0.05或 P＜0.01），卡托普利组对TG、TC、LDL-c、HDL-c含量及 CRI均无明显影响（P＞0.05），详见表 3。

表3 联合用药对糖尿病性心肌病大鼠血脂的影响（x±s）

2.4 对糖尿病性心肌病大鼠血清GSP及心肌组织TNF-α及IL-1β含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清GSP及TNF-α及IL-1β含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，GFS、TFMP及联合用药组均可使血清GSP、TNF-α及IL-1β 含量明显降低（P＜0.05 或 P＜0.01），卡托普利组可使血清TNF-α及IL-1β含量明显降低 （P＜0.05或P＜0.01），对 GSP 含量无明显影响（P＞0.05），详见表 4。

表4 联合用药对糖尿病性心肌病大鼠GSP、TNF-α及IL-6的影响（x±s）

2.5 对糖尿病性心肌病大鼠心肌组织氧化应激的影响

与对照组比较，模型组大鼠心肌组织SOD、GSHPx活性显著降低，MDA 含量显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，GFS、TFMP、联合用药及卡托普利组均可使心肌组织SOD、GSH-Px活性显著提高，MDA含量显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），详见表 5。

表5 联合用药对糖尿病性心肌病大鼠心肌组织氧化应激的影响（x±s）

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并发症之一，主要是由心肌能量代谢异常，包括糖和乳酸盐代谢减少，脂肪代谢增加导致游离脂肪酸堆积以及体内稳态失衡。在此基础上出现氧化应激，最终导致细胞凋亡、炎症反应增加、内皮功能紊乱以及心肌纤维化等病理生理改变。本实验采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ注射诱导大鼠2型糖尿病，模型成功后继续高脂饮食喂养12周，维持大鼠体内高血脂状态。研究表明，模型组大鼠FBG及GSP均明显增高，心室重量/体重比增加，HE染色显示心肌损伤严重。GFS与TFMP联合用药能明显改善心肌病理组织形态改变，提示对大鼠2型糖尿病心肌病变具有保护作用（另文发表）。本实验研究表明，糖尿病性心肌病大鼠血清TG、TC、LDH-c明显升高，HDL-c下降。这是糖尿病出现代谢紊乱的表现，是糖尿病心肌病发生的基础。GFS与TFMP联合用药12周能明显降低大鼠血清TG、TC、LDH-c，升高HDL-c，提示其能通过改善2型糖尿病大鼠血脂紊乱，改善糖尿病性心肌病引起的心肌细胞收缩功能异常。

Evans等[11]认为，高糖引起的组织及细胞损伤最早出现的是氧化应激。体内抗氧化酶SOD、CAT及GSH-Px等在糖尿病心肌病中起重要作用。本实验结果显示，高糖高脂伴小剂量STZ可导致2型糖尿病大鼠心肌组织SOD和GSH-Px活性下降，MDA含量上升，提示糖尿病已引发了心肌组织氧化应激的发生。GFS与TFMP联合用药可使SOD及GSH-Px活性明显上升，MDA含量明显下降，表明其可通过改善高糖诱导的氧化应激损伤保护糖尿病心肌病变。炎性因子主要以IL-6、TNF-α为主导。TNF-α通过激活细胞因子级联反应，促进氧自由基产生，活化中性粒细胞，诱导心肌细胞凋亡等方式，加重心肌损伤。研究表明，心肌细胞产生的IL-6主要由缺血及再灌注诱导[12]。GFS与TFMP联合用药使血液中IL-6、TNF-α浓度降低，表明其也通过抗炎作用保护心肌，也可能通过影响TNF-α参与的死亡受体通路激活的心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。