肾叶打碗花抗氧化活性及抑制酪氨酸酶研究

尚金燕，李桂荣，邵明辉，邹小丽，李庆亮

（山东药品食品职业学院·山东威海·264210）

肾叶打碗花Calystegia soldanella(Linn.)R.Br.又称为扶子苗、孝扇草、滨旋花、肾叶天剑。分布在山东、辽宁、河北、浙江、江苏、台湾等沿海地区[1]，是一种多年生的匍匐性草本植物，生长在海滨沙地上，或者海岸的岩石缝中。

肾叶打碗花作为药用已有悠久的历史，《本草纲目》记载该植物，花：甘；根：辛、温、无毒；全草：甘滑微苦、能利雄黄；“花能去面皮干黑色，媚好益气；根可去腹中寒热邪气，利小便”[2]。

已有的研究表明，肾叶打碗花中总黄酮含量较高[3]，而黄酮类化合物与抗氧化活性密切相关[4]。当然，是否还有其他具有抗氧化活性的天然产物，还需要进行下一步的研究。为了充分开发利用该植物资源，本研究以乙醇作为有机溶剂，研究了其乙醇提取物的抗氧化活性和抑制酪氨酸酶的活性。

1 材料与设备

1.1 材料

本研究所用肾叶打碗花，采自山东威海荣成成山林场，用烘箱50℃烘干，用粉碎机将全草粉碎，过60目筛得粉末。

1.2 试剂

DPPH、L-酪氨酸、酪氨酸酶，Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、水杨酸、HCl、H2O2、乙醇、均为分析纯。

1.3 仪器与设备

紫外分光光度计T6型 （北京普析通用仪器有限责任公司）；酶标仪ER-504（山东博科科学仪器有限公司）；十万分之一电子天平ME55（梅特勒）；IKA RV10 Basic旋转蒸发仪RE-301（上海科兴仪器有限公司）。

2 实验方法与结果

2.1 有效成分提取

准确称量5.010g肾叶打碗花粉末，加入50%的乙醇100mL，室温浸泡24h，然后80℃回流提取浸泡液3h，冷却过滤，收取滤液；残渣中再次加入500mL体积分数50%的乙醇，在80℃下继续回流提取3h，冷却过滤，收取滤液，将两次滤液合并，置于旋转蒸发仪上，50℃温度下浓缩，得到肾叶打碗花膏状提取物。

2.2 抗氧化活性实验

2.2.1 DPPH·清除能力实验

参照文献方法[5～7]测定肾叶打碗花提取物DPPH·清除能力。准确称取避光冷藏保存的DPPH 30.90 mg，加入无水乙醇溶解于250 mL棕色容量瓶中，避光保存，备用。

用乙醇稀释肾叶打碗花提取物，分别稀释成质量浓度为 0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg.mL-1， 分别取不同质量浓度的提取物1mL、0.2mmol.L-1DPPH乙醇溶液1.5mL于试管中，混合摇匀后，立刻放置于暗室中，反应1h。使用无水乙醇调零，测定波长517nm处的吸光值为Abs样本。重复操作，将样本用无水乙醇替换，测定吸光值为Abs空白。测定不同浓度提取物对DPPH·的清除率，绘制清除率对提取液浓度曲线，根据线性方程计算清除率为50%时的浓度值，即得到IC50。

DPPH·清除率计算如下:

DPPH·清除率(%)=(1-Abs样本/Abs空白)×100

图1 肾叶打碗花提取物对DPPH·的清除效果

由图1可以看出，随着提取液浓度的增加，DPPH·清除率逐渐升高，在最大样品浓度下，清除率达到60.24%，肾叶打碗花乙醇提取物清除DPPH·的IC50约为2.885mg.mL-1。结果表明，肾叶打碗花乙醇提取物对DPPH·有一定的清除效果，乙醇提取物具有一定的抗氧化性。

2.1.2 ·OH清除能力实验[8]

H2O2与Fe2+反应产生·OH，在反应体系中加入水杨酸后，·OH与水杨酸反应，生成有色物质，在波长510nm处该物质有最大吸收。如果向反应体系中加入具有清除羟自由基功能的被测物，就会减少生成的自由基，从而使有色物质的生成量减少。体系中先加入FeSO4（9mmol.L-1） 1mL、水杨酸-乙醇溶液（9mmol.L-1）1mL，不同提取浓度样品溶液1mL。 最后加H2O2（8.8mmol.L-1）1 mL 启动反应，37℃下反应 0.5h。以蒸馏水作为对照，测定510nm处各样品溶液的吸光值。考虑样品本身存在的吸光值，以FeSO4（9 mmol.L-1）1mL、水杨酸-乙醇溶液（9mmol.L-1）1mL、不同浓度样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值。按以下公式计算样品·OH清除率。

·OH 清除率（%）=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100

其中：A0—空白对照溶液的吸光值；Ax—样品溶液的吸光值；Ax0—不加H2O2样品溶液的吸光值。

图2 肾叶打碗花提取物对·OH的清除效果

由图2可以看出，肾叶打碗花提取物对·OH的清除作用随着浓度的增加而增强，表明肾叶打碗花乙醇提取物具有较好的清除·OH的作用。

2.1.3 O2-·清除能力实验

清除O2-·的实验参照文献进行[9]，实验利用邻苯三酚来测定。取4.5 mL 50 mmol.L-1Tris-HCl（pH8.2）缓冲液，放置于25℃的水浴中，保温作用20min，加入1mL样品溶液、0.4mL 25mmol.L-1邻苯三酚溶液，混合均匀，然后放置于25℃水浴中，反应5min，最后加入1mL 8mmoll.L-1HCl终止反应，测定299nm处吸光度（Ax）。空白对照组（A0）以同样体积的蒸馏水来替换样品。每个样品重复3次，测量后取平均值，根据以下公式来计算O2-·的清除率。

O2-·清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100

图3 肾叶打碗花提取物对O2-·的清除效果

如图3所示，在邻苯三酚自氧化体系中，随着提取液浓度的增加，抑制自氧化的能力也增强，很好的起到了清除超氧阴离子的作用。

2.2 抑制酪氨酸酶活性实验[10]

精确称取肾叶打碗花乙醇提取物，以PBS缓冲溶液作为溶剂， 配制成浓度依次为 2、6、10、12、20mg.mL-1的样品溶液。在96孔板中分别添加以下物质：不同稀释浓度样品溶液50μL、PBS缓冲液80μL、酪氨酸酶溶液 50μL，分别设置 3个复孔，37℃下作用10min，然后向每个加样孔中加入20μL底物，孵育30min，最后用酶标仪来测定475nm处的吸光值，每个样品重复测量3次。记录吸光值。酪氨酸酶抑制率的计算公式如下：

抑制率 =[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100%，

公式中，A是空白对照组（PBS 130μL+酶 50μL+底物 20μL）；B 是空白背景组 （PBS 180μL+底物20μL）；C 是不同浓度样品组（PBS 80μL+酶 50μL+样品溶液 50μL+底物 20μL）；D 是实验背景组（PBS 130μL+供试品溶液 50μL+底物 20μL）。

表1 不同浓度提取物对酪氨酸酶的抑制率

如表1所示，肾叶打碗花乙醇提取物对酪氨酸酶催化活性具有明显的抑制作用，而且随着浓度的升高而增强，IC50值为2.95 mg/mL。

3 结论

为了分析肾叶打碗花的抗氧化活性，本研究用乙醇作为溶剂，提取了肾叶打碗花提取物，对其清除DPPH·、·OH、O2-·的能力和抑制酪氨酸酶活性进行了测定。实验结果表明，肾叶打碗花乙醇提取物对各种自由基均具有一定的清除能力，并能抑制酪氨酸酶的活性。

肾叶打碗花可以入药，已有研究者提取了该药材的有效成分进行了分析探讨。Motoo Tori从孝扇草的茎中分离出反式-4-羟基桂皮酸酯、反式-4-羟基桂皮酸和反式-3,4-二羟基桂皮酸[11]。黄真等发现该药材的水提液具有较强的抗炎镇痛作用[12]。但目前关于肾叶打碗花抗氧化活性方面尚未有研究。本研究以乙醇作为有机溶剂，提取了其有效成分，研究其抗氧化活性，后期将进一步研究该植物的抗氧化活性，研究其他不同溶剂提取物的抗氧化作用，并通过实验研究，跟踪分离提取活性有效成分，为开发该药材抗氧化药物和抗氧化制剂奠定基础。