HPLC测定茵栀黄方剂中4味药材的主要成分及含量

张玉姗,孙一斐,罗莉,李作铭,张珊滋,姚新成,2

(1.石河子大学 药学院,新疆 石河子 832000; 2.新疆植物药资源利用教育部重点实验室,新疆 石河子 832000)

“茵栀黄”系列成方制剂由中医古方“茵陈蒿汤”(出自张仲景《伤寒论》)衍生转化而来,主要用于胆汁淤积型肝脏疾病的退黄治疗[1-3].该方由茵陈(滨蒿或茵陈蒿)、栀子、黄芩和金银花4味药材的提取物组成[4].该方中的4味药材具有清热利湿、泻火解毒的功效,协同作用可退黄疸[5].现代药理研究表明茵陈、栀子、黄芩和金银花中含有多种具有保肝利胆和抗炎功效的活性成分[6].在临床上,茵栀黄汤剂应用了近百年,治疗各种黄疸型肝炎疗效确切,特别是针对新生儿胆汁淤积型黄疸病的退黄治疗,效果尤为显著.

茵栀黄复方所含的药理活性成分复杂.邱小玉[7],张楠[8]等对茵栀黄口服液中的多个有效成分进行了测定,结果表明新绿原酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和对羟基苯乙酮等成分含量的批间差异较大；张玉姗[9],陈永刚[10]等分别建立了HPLC同时对茵栀黄颗粒中多个化学成分含量测定的方法,研究表明不同批次颗粒剂中异绿原酸A、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷和千层纸素A等成分的含量具有一定差异.分析认为造成差异的原因可能是不同批次的制剂所使用的原料药材产地不同、采收时间不同、加工方法不一致等,从而导致提取物存在一定的质量差异.以上研究主要集中在茵栀黄复方成剂，如注射液、颗粒、口服液等,极少报道测定复方药材提取物含量的研究.目前2015年版《中华人民共和国药典》一部对茵栀黄复方的整体质量控制仍比较局限,仅对茵陈提取物中的对羟基苯乙酮和绿原酸、栀子提取物中的栀子苷,黄芩提取物中的黄芩苷和金银花提取物中的绿原酸进行了含量测定和质量控制[4],仅测定这几种成分难以充分反映和保证制剂批次间稳定性.目前对于构成茵栀黄复方药材的研究多为直接对其纯化分离进而分析化学成分,极少建立对药材标准提取物成分分析及含量测定的方法.对于4味药材提取物有如下相关研究.张昀[11]、何峰[12]等用HPLC测定了舒肝宁注射液的茵陈提取物和栀子提取物中绿原酸及栀子苷的含量；丁芳林[13]等建立了测定黄芩超声提取物中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的方法；陈有根[14]、范毅[15]等建立了测定金银花提取物中绿原酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸和木犀草苷含量的方法,但这些研究所涉及的植物提取物多为超声提取或按照其他复方标准提取,与《中华人民共和国药典》所记载茵栀黄复方中各味药材提取物的制备方法相差甚远.由于药材在其加工过程中采用不同的提取工艺、制备方法均可导致活性成分的种类和含量不同,故现有的研究不能作为衡量茵栀黄复方中药材标准提取物质量的依据.

本研究在借鉴前人工作基础上,采用HPLC对茵栀黄方剂中4味药材的标准提取物(按照《中华人民共和国药典》制取)进行分析测定,又选取了新绿原酸、1.3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷及千层纸素A等指标成分对这4种药材的提取物进行质量控制,克服现有质量控制指标单一的不足,力求全面评价该复方,从药材源头有效保障制剂质量,可用于茵栀黄系列产品的质量提升.

1 仪器与材料

1.1 仪器

SSI HPLC色谱仪,1000型紫外检测器(美国科学系统仪器公司);迪马公司Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱;KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ES 225SM-DR型十万分之一天平(SWISS MADE).

1.2 药材与试剂

茵陈、栀子、黄芩、金银花均购自安徽药知源中药饮片有限公司,经石河子大学药学院李鹏副教授鉴定.茵陈为菊科植物茵陈蒿(ArtemisiacapillarisThunb.)的干燥地上部分;栀子为茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis.)的干燥果实;黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.)的干燥根茎;金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾.药材样品保存在石河子大学中药学系植物标本室.1,3-二咖啡酰奎宁酸(批号AF8030809)、异绿原酸B(批号AF7080124)、异绿原酸C(批号AF7060542)、栀子苷(批号AF7110308)、黄芩苷(批号AF7061702)、汉黄芩素(批号AF7121402)、黄芩素(批号AF8030808)、汉黄芩苷(批号AB7100922)、千层纸素A(批号AF7110209)、新绿原酸(批号AF7050442)均购自成都埃法生物科技有限公司;绿原酸(批号110753-200413)购自中国药品生物制品检定所;异绿原酸A(批号161022)购自成都昂赛思生物科技有限公司.以上对照品质量分数均不低于98% (HPLC测定).甲酸、甲醇为分析纯,乙腈为色谱纯,水为超纯水.

2 实验方法

2.1 色谱条件

Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱;流动相为乙腈(A)-0.1%(体积分数)甲酸水溶液(B),流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量20 μL.茵陈提取物(YCE)洗脱条件(体积分数):0～7 min,20% A;7～13 min,20%～25% A;13～20 min,25%～40% A,检测波长327 nm.栀子提取物(ZZE)洗脱条件(体积分数):0～5 min,15%～26% A;5～8 min,26%～31% A;8～19 min,31%～33% A,检测波长238 nm.黄芩提取物(HQE)洗脱条件(体积分数):0～5 min,15%～33% A;5～8 min,33%～37% A;8～25 min,37%～50% A;25～35 min,50%～55% A,检测波长280 nm.金银花提取物(JYHE)洗脱条件(体积分数):0～7 min,15%～20% A;7～10 min,20% A;10～12 min,20%～30% A;12～20 min,30%～40% A,检测波长327 nm.

2.2 茵栀黄方剂中4味药材提取物的制备

根据《中华人民共和国药典》茵栀黄复方各味药材标准提取物的制备方法制备茵陈、栀子、黄芩和金银花的提取物[4].提取物冷冻干燥,备用.

2.3 对照品溶液的制备

取绿原酸、1.3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、栀子苷、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A及新绿原酸标准品适量,精密称定,用甲醇分别配制成1 mg/mL的对照品储备液,各对照品储备液均用0.22 μm微孔滤膜过滤,备用.依次精密吸取绿原酸、1.3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品储备液各0.1 mL,黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A对照品储备液各0.1 mL,新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A对照品储备液各0.1 mL分别置于3个10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,混匀,即得混合对照品溶液A、B、C.将上述溶液于4 ℃保存,备用.

2.4 供试品溶液的制备

分别精密称取茵陈、栀子、黄芩和金银花提取物各0.20 g,置于50 mL的容量瓶中,加甲醇50 mL充分溶解,摇匀,过滤,弃去初滤液,取续滤液过0.22 μm微孔滤膜,即得.

2.5 茵栀黄提取物的化学成分分析

分别取“2.4”项下的供试品溶液及“2.3”项下的混合对照品溶液按各色谱条件进样20 μL分析.

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察

精密吸取“2.3”项下对照品储备液适量,分别定量稀释制备成系列标准溶液.按“2.1”项下色谱条件进行分析,以质量浓度(x,μg/mL)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，回归方程见表1.

2.6.2 精密度实验

精密吸取各混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积.

2.6.3 稳定性实验

吸取同一供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样,测定峰面积.

2.6.4 重复性实验

分别称取茵陈、栀子、黄芩和金银花提取物适量,按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,测定峰面积.

2.6.5 加样回收率实验

精密称取6份已知含量的茵陈、栀子、黄芩和金银花提取物各0.10 g,按各成分质量分数的80%、100%、120%分别加入对照品溶液,按“2.4”项下方法制成供试溶液,在“2.1”项色谱条件下测定,计算各成分的加样回收率以及RSD.

2.7 样品测定

分别称取3个批次的茵陈、栀子、黄芩和金银花提取物适量,按“2.4”项下方法平行制备3份供试品溶液,进样测定峰面积,代入回归方程,计算各成分在样品中的含量.

3 结果与分析

3.1 茵栀黄提取物的化学成分分析结果

如图1-4所示,各提取物中的物质峰分离度、峰形良好、基线平稳,经与标准品相对保留时间比对共确定14个化学成分.

1.绿原酸；2.1,3-二咖啡酰奎宁酸；3.异绿原酸B；4.异绿原酸A；5.异绿原酸C.

1.栀子苷.

1.黄芩苷；2.汉黄芩素；3.黄芩素；4.汉黄芩苷；5.千层纸素A.

1.新绿原酸；2.绿原酸；3.异绿原酸A.

3.2 方法学考察结果

3.2.1 线性关系

如表1所示,目标成分在各自质量浓度范围内线性关系良好.

表1 茵栀黄方剂4味药材提取物中各成分的线性关系Tab.1 Linear relationship of components in the four medicinal materials of Yinzhihuang formula

3.2.2 精密度

YCE中绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD值分别为1.5%、0.78%、2.4%、1.9%、1.8%；ZZE中栀子苷峰面积的RSD值为2.1%；HQE中黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A峰面积的RSD值分别为2.3%、2.2%、1.5%、2.1%、2.0%；JYHE中新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A峰面积的RSD值分别为1.2%、1.0%、1.5%,结果表明仪器精密度良好.

3.2.3 稳定性

YCE中绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD值分别为2.4%、2.3%、2.4%、1.7%、2.1%；ZZE中栀子苷峰面积的RSD值为2.5%；HQE中黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A峰面积的RSD值分别为1.8%、0.2%、2.3%、2.1%、0.73%；JYHE中新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A峰面积的RSD值分别为1.2%、1.7%、2.3%,结果表明供试品溶液在24 h内稳定.

3.2.4 重复性

YCE中绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的平均质量分数分别为28.09、10.20、8.754、10.02、6.119 mg/g,RSD值分别为1.9%、2.4%、1.7%、2.1%、2.1%；ZZE中栀子苷的平均质量分数为292.3 mg/g,RSD值为0.87%；HQE中黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A的平均质量分数分别为275.5、6.173、29.96、15.69、6.337 mg/g,RSD值为1.8%、1.9%、2.2%、2.1%、2.3%；JYHE中新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A的平均质量分数分别为7.245、24.81、28.91 mg/g,RSD值分别为2.1%、2.4%、2.2%,结果表明该方法的重复性良好.

3.2.5 加样回收率

如表2所示,4味药材提取物中各目标成分的加样回收率在95%～105%,RSD值均小于2.5%.

表2 加样回收率结果 (n=6)Tab.2 Results of recovery (n=6)

续表2Continue Tab.2

3.3 样品测定结果

表3为3个批次药材(S1、S2、S3)所制提取物的含量测定结果.

表3 茵栀黄中主要化学成分含量测定结果 (n=3)Tab.3 Determining results of main chemical components in Yinzhihuang (n=3)

4 结论

本研究采用HPLC对茵栀黄方剂4味药材标准提取物中的绿原酸、1.3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、栀子苷、黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A及新绿原酸等成分进行了定性和定量分析,结果表明在本实验建立的色谱条件下,所测成分色谱峰与其他成分分离度良好,各项方法学验证符合要求,方法简便,测定结果准确,为保证该方剂的安全性和有效性提供标准,为该方剂的药效物质基础研究及其药材提取物主要化学成分的质量控制评价提供可靠依据.