阻塞性睡眠呼吸暂停患者口咽菌群构成及其相关性分析

杨文博，姚晓光，木拉力别克·黑扎提，王磊，邵亮，李南方

(1.石河子大学医学院，新疆 石河子 832000； 2.新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心 新疆高血压研究所，乌鲁木齐 830001)

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)是一种以睡眠时上气道口咽水平反复塌陷，进而出现周期性呼吸暂停及低通气为特征的常见睡眠障碍性疾病[1]。研究发现，OSA与高血压、冠心病、糖尿病、脂质代谢紊乱等疾病有关，在女性中发病率为4%～9%，男性中为9%～24%[2-3]。目前认为上气道炎症是OSA发病的主要原因，但OSA病因复杂，具体的发病机制目前仍不清楚[4-5]。人类口腔中存在大量微生物，人与口腔微生物在长期的进化过程中形成了相对稳定的共生状态，这些微生物参与调节口腔黏膜稳态免疫，并与多种局部及全身性系统疾病有关[6-8]。口咽作为上气道的中部，是OSA患者睡眠过程中反复塌陷的部位，也是存在大量炎症的部位[4,9]。观察OSA患者口咽局部菌群的多样性及组成变化，研究口咽局部菌群的多样性及组成变化与OSA的关系可能为研究OSA的发病机制提供新的线索。本研究采用目前高效准确的二代测序方法16S rDNA测序[10-11]探测中重度OSA患者的局部菌群多样性及组成，继而探讨口咽菌群与OSA之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2013年4—12月在新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心住院完成多导睡眠监测并同意提供咽拭子标本的51例男性疑诊OSA(无诱因白天嗜睡者，本人、家人或同病房患者述有夜间打鼾)患者为研究对象。排除标准：心肌梗死或脑卒中<6个月等心脑血管疾病；糖尿病、甲状腺疾病等内分泌疾病，急慢性呼吸道疾病；全身炎症性疾病；4周内使用过糖皮质激素、抗生素或其他抗炎类药物，中枢性睡眠呼吸暂停，轻度OSA及嗜酒患者。上述患者根据睡眠呼吸暂停低通气指数(apnea hypopnea index，AHI)[12]分为三组：非OSA(AHI<5)组(n=25)、中度OSA(15≤AHI<30)组(n=15)和重度 OSA(AHI≥30)组(n=11)。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2多导睡眠监测 睡眠监测采用澳大利亚Compumedics公司生产的44道睡眠监测仪。软件为Profusion PSG睡眠分析软件，所有研究对象均完成夜间连续7 h以上的睡眠监测。

1.3生化指标测定 所有研究对象在完成多导睡眠监测次日8：00抽取外周静脉血进行生化指标测定，包括总胆固醇、三酰甘油、空腹血糖、C反应蛋白。

1.4咽拭子标本的采集 在多导睡眠监测完成后次日清晨进行咽拭子标本采集，所有研究对象均禁止刷牙、漱口、吃早餐，用洁净的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁。咽喉取样时，拭子不能接触到牙齿、口腔和舌黏膜，然后将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。标本收集完后，将标本放在-80 ℃的冰箱中保存。

1.5细菌DNA的提取及测序 将采集好的咽拭子标本进行DNA提取，对DNA样品进行浓度、片段分布、OD260/280和OD260/230检测，将高质量样本进行后续的生物信息学分析。对高质量样品构建文库，数据处理过滤时滤除低质量的reads，利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的Tags，然后通过UPARSE-OTU算法按照97%相似度为分界聚类出一系列OTU，生成OTU的代表序列。通过RDP classifer软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释。首先对得到的OTU进行细菌注释分类，然后对各个检测标本做出多样性指数ace稀释曲线图，在目分类水平做出细菌相对丰度点线图，对各组标本进行组内多样性及物种构成分析。使用R(v3.0.3)软件绘制OTU Rank曲线来初步衡量样本中所含物种的丰富程度和均匀程度。

2 结 果

2.1三组一般资料比较 三组年龄、吸烟率、体质指数、腹围、总的睡眠时间、睡眠效率比较差异无统计学意义(P>0.05)；三组最低血氧饱和度比较差异有统计学意义(P<0.05)，中度和重度OSA组最低血氧饱和度低于非OSA组，重度OSA组低于中度OSA组(P<0.05)。见表1。

2.2三组生化指标比较 三组总胆固醇、空腹血糖、C反应蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05)；三组三酰甘油比较差异有统计学意义(P<0.05)，中度和重度OSA组三酰甘油高于非OSA组，重度OSA组高于中度OSA组(P<0.05)。见表2。

2.3测序深度及物种丰富度、均匀度分析 ace指数在抽取到10 000个测序序列时达到平台期，不随抽取序列数的增加而增加，更多的测序序列对多样性指数ace的增加贡献少，样本测序的结果足以捕获微生物的多样性，见图1。40个高质量样本(其中非OSA组14例，中度OSA组15例，重度OSA组11例)共产生461种OTU。在丰度上，大多数OTU的丰度在1%以下。在均匀度上，曲线下降不平坦，各个标本中物种的均匀度不高，优势菌的丰度为10%～100%，见图2。

2.4目分类水平组内多样性及物种组成分析 在目分类水平上，随着OSA程度加重，组内多样性逐渐降低：除未分类细菌外，非OSA组探测到37种细菌，中度OSA组探测到33种，重度OSA组32种。所有样本均以拟杆菌目、梭菌目、奈瑟菌目、梭杆菌目、乳酸杆菌目、巴斯德菌目占主导地位。其中，中度、重度OSA组奈瑟菌比例均明显升高，见图3。

2.5目分类水平菌群组间多样性分析 中度OSA组未检测到链球菌目，重度OSA组未检测到红杆菌目，中度及重度OSA组均未检测到不等鞭毛菌目；与非OSA组相比，中度OSA组和重度组肠杆菌目丰度明显降低(Pfdr<0.05)，重度OSA组海洋螺菌目、交替单胞菌目丰度明显降低(Pfdr<0.05)，中度OSA组柄杆菌目丰度明显降低(Pfdr<0.05)；中度OSA和重度OSA组间多样性相似，未发现差异细菌。见表3。

2.6差异菌与OSA及临床资料的相关性分析 相关性分析结果显示：肠杆菌目、海洋螺菌目、交替单胞菌目、红杆菌目、不等鞭毛菌目的丰度与AHI呈负相关(P<0.01)，链球菌目、柄杆菌目的丰度与AHI无相关性(P>0.05)；除柄杆菌目的丰度与体质指数呈负相关(P<0.05)外，其他差异菌与体质指数无相关性(P>0.05)；各差异菌丰度与年龄无相关性(P>0.05)。见表4。

表1 非OSA组与中度、重度OSA组一般资料比较

表2 非OSA组与中度、重度OSA组

Number of sequences sampled:抽取的Tag数量；Rarefaction Measure:ace:ace指数测量值；A：非OSA组；B：中度OSA组；C：重度OSA组

Relative abundance：OTU的相对丰度；Number of OTUs：OTU的丰度排序；A：非OSA组；B：中度OSA组；C：重度OSA组

OSA:阻塞性睡眠呼吸暂停；其他：物种丰度在所有样品低于0.5%的物种

表3 三组目分类水平菌群组间多样性比较

表4 差异菌与AHI、体质指数及年龄的相关性分析

3讨 论

口腔微生物组成复杂,种类繁多，在美国国立口腔与颌面研究所建立的人体口腔微生物组数据库中共记录了13个细菌门，约700种人类口腔微生物[13]。口腔生态系统的平衡对人类健康有重要影响。研究OSA与口腔局部菌群之间的关系，维护菌群的动态平衡意义重大。本研究采用目前成熟、高效的第二测序技术(16S rDNA测序)分析了OSA患者的口咽微生物组成及与OSA之间的关系。

OSA患者因睡眠时反复出现上气道的部分或完全塌陷，睡眠过程中鼻腔气流减少，引起打鼾及张口呼吸[14]，使得口腔直接暴露在灰尘、颗粒物和各种空气微生物中，加之夜间反复的气道内压力的剧烈变化及经鼻气流的减少使气道内气体湿度与含氧量下降，口咽的微生物因微环境改变而受到影响[15]。因此，OSA患者口咽菌群组成及多样性改变，存在失调。

在探测到的细菌种类上，随OSA的加重而逐渐减少。而细菌多样性的降低通常与各种疾病相联系，包括糖尿病、肥胖症和慢性呼吸道疾病(如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)[16-19]。Lu等[20]研究发现肺炎患儿的口咽及鼻咽菌群多样性也存在降低的现象。同样，肠道菌群多样性的降低是腹泻、炎性肠病、艰难梭菌感染等多种疾病的标志[21]，短链脂肪酸产生菌在调节肠道内pH值、抑制炎症反应、建立肠道环境中起关键作用[22]。Wu等[23]通过对OSA患者的鼻腔灌洗液进行微生物群及炎症因子分析，发现了与OSA及炎症标志物相关的鼻咽微生物变化。有研究在重度OSA组中鉴定出了具有特征性的富集菌群，如链球菌、普雷沃菌、韦荣菌和卟啉单胞菌等，OSA组鼻腔灌洗液中的白细胞介素-6和白细胞介素-8水平显著高于非OSA组；对OSA组中不同水平的IL-6和IL-8进行分组发现，两组鼻腔菌群的组成比较差异有统计学意义。进一步证实了OSA患者局部菌群与炎症之间的关系[23]。口腔各种微生物之间的平衡对气道抵御外界病原菌有重要作用，局部微生态的改变，特别是局部菌群多样性的降低会造成局部免疫系统失衡[24]，而中重度OSA人群的口咽菌群多样性降低可能是导致OSA局部及系统炎症的原因之一。呼吸道的特定部位定殖有相对固定的细菌群落[25]。当菌群处于动态平衡时，气道微生物可抵御多种病原菌的入侵和生长，而这种平衡的破坏可能产生不良后果[26]。口咽部的定植菌有链球菌、奈瑟菌、罗氏菌和厌氧菌，包括韦氏菌、普雷沃特菌和韦荣球菌[25,27-28]。本研究中，随着OSA程度的加重，奈瑟菌和梭杆菌比例增加，尤其是奈瑟菌，这可能会对局部微环境的动态平衡产生不利影响。口腔及十二指肠黏膜中奈瑟菌的过度生长可导致免疫系统异常活化，诱导细胞炎症的产生[29-30]。OSA患者口腔发生的炎症状态可能有利于Neisseria菌株的定植，促进Neisseria维持促炎状态。然而，梭杆菌与疾病关系的研究有限，与OSA的关系需要深入研究。

肠杆菌作为肠道的富集菌群可通过不良的口腔习惯，如吮指等行为进入口腔[31]，肠杆菌可作为机会致病菌引起菌血症[32]，而肠杆菌与OSA的关系目前研究较少，值得进一步深入研究。海洋螺菌、交替单胞菌、红杆菌及不等鞭毛菌与OSA人群中丰度下降，且与OSA的严重程度呈负相关。然而海洋螺菌、交替单胞菌、红杆菌及不等鞭毛菌与人体疾病或健康的研究较少见报道，这可能是未来研究的方向。

综上所述，OSA患者口咽菌群组成改变，多样性降低，部分菌群与OSA的严重性具有相关性，这为OSA患者口咽菌群失调提供了证据，为OSA的发病机制提供了新的探索方向。