抗菌肽LL-37在几种常见口腔疾病中的作用

姚佳，黄宇欣，高豪，汪洋

(西安医学院基础医学部病原生物学教研室，西安 710021)

抗菌肽，又称为抗微生物肽、肽抗生素、宿主防御肽，是生物体特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽。自发现天蚕素以来，目前已有超过2 900种天然抗菌肽被报道，其中76%以上来源于动物[1]。按结构特征的不同，动物抗菌肽可分为杀菌肽、防御素和组织蛋白酶抑制素Cathelicidin，存在于人体的内源性抗菌肽主要包括Cathelicidin和防御素两类。口腔是全身细菌储量仅次于肠道的微环境，在正常情况下，口腔内的微生物与宿主之间存在着共生和拮抗的平衡关系，而存在于人体的抗菌肽在调节口腔微生态平衡、抵御病原体入侵方面发挥重要作用。作为唯一的人源Cathelicidin类抗菌肽，LL-37是人体固有免疫的重要组成部分，对于口腔健康至关重要。目前研究已发现LL-37与多种口腔疾病的发生、发展具有密切联系。现就LL-37在几种口腔疾病发生、发展中所起的作用予以综述，以期为口腔健康和局部微环境的维系、口腔疾病的发生发展和治疗提供新思路。

1 LL-37

人源阳离子抗菌肽-18(human cationic antimicrobial peptide-18，hCAP-18)是目前已发现的唯一人源Cathelicidin类抗菌肽。hCAP-18可由中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和树突状细胞表达，但在炎症、感染等情况下表达明显增加，具有放大Toll样受体信号的功能，其通过改变细菌细胞膜渗透压而使细菌死亡，并参与宿主的防御反应[2-3]。

在正常情况下，hCAP-18在细胞内以无活性的前肽形式被合成和储存，其基因启动子区域含有一个白细胞介素-6核因子的识别位点，白细胞介素-6可能通过蛋白酪氨酸激酶/信号转导及转录激活因子通路或大鼠肉瘤病毒蛋白/促分裂原活化的蛋白激酶级联活化白细胞介素-6核因子，从而激活hCAP-18基因的表达。hCAP-18的前肽包含一个信号肽、Cathelin保守区以及C端的功能区，分子量约为19 300。在受到外界刺激后，hCAP-18可由胞内释放至胞外，并在这一过程中去掉信号肽，成为分子量约为18 000的hCAP-18，再经丝氨酸蛋白酶3作用剪切掉Cathelin保守区，释放出C端具有活性的小分子多肽，该小分子多肽由37个氨基酸构成，因其N端前两位为亮氨酸故被研究者们称为LL-37[4]。

2 LL-37与常见口腔疾病

口腔是消化系统的起始部分，口腔健康可以直接或间接地影响全身健康，世界卫生组织早已将口腔健康定为人体健康十大标准之一。口腔内适宜的温度、湿度和营养源为微生物提供了良好的定植环境，使得口腔成为人体内仅次于肠道的微生物聚集场所。这些微生物之间、微生物和宿主免疫系统之间保持着微妙的微生态平衡，维系着口腔的内环境稳定，并抵御外界不良因素对机体的侵袭。作为固有免疫的重要组成部分，LL-37可在低水平下发挥抗感染、免疫调节、诱导肿瘤细胞凋亡等重要作用，参与口腔内环境的稳定和口腔微生态的平衡。当口腔中LL-37的表达出现异常，微生态平衡被打破时，可导致诸如龋病、牙周炎以及黏膜溃疡等口腔疾病[5]。

2.1龋病 龋齿是一种口腔常见的细菌性疾病，也是学龄前儿童牙齿缺损的常见原因。根据全国第四次口腔健康流行病学调查结果显示，12岁儿童恒牙患龋率为34.5%，5岁儿童乳牙患龋率为70.9%[6]。唾液中抗菌肽含量与儿童龋齿的相关性很早即被研究者发现。

Ribeiro等[7]对106名儿童的唾液肽进行分析发现，口腔中的α-防御素3和β-防御素3均能降低早期幼儿龋齿的发病率。Colombo等[8]研究也指出，LL-37在龋齿儿童唾液中的表达与β-防御素2/3呈正相关。

变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是口腔中常见的微生物，因其具有容易形成生物膜的特点，故有助于牙菌斑的形成。长期研究证明，S.mutans在口腔中的水平与龋坏的程度呈正相关[9]。Malcolm等[10]对57名12～24月龄的儿童进行了牙菌斑和唾液的收集，并在3岁时对其中23人进行了复检。结果发现，随着年龄增长，LL-37和S.mutans 的水平均升高，且在S.mutans感染最严重的儿童唾液中，LL-37的水平最高。但这种情况并不能说明口腔中水平升高的LL-37刺激了S.mutans的生长；作为重要的口腔抗菌肽，LL-37可与S.mutans脂磷壁酸相互作用，从而影响S.mutans的吸附，抑制其生物被膜的形成，减少牙菌斑的产生[11-12]。此外，LL-37还可以通过“地毯式”杀伤模式造成口腔内其他病原性细菌的死亡，LL-37在这些细菌表面聚集，以α-螺旋插入细菌细胞膜，破坏细胞膜的完整性，引起细菌死亡，这些功能均有助于减少龋坏的形成[12]。可见，当口腔中S.mutans数量升高，形成牙菌斑造成龋坏时，LL-37及口腔中其他唾液肽的表达也一同增加，联合发挥抗菌作用抑制S.mutans的生长，维系口腔内环境的稳定[13]。

但在严重龋坏的儿童唾液中，高水平的LL-37和其他唾液肽却无法阻止牙菌斑和龋坏的发生，Phattarataratip等[14]通过分析此现象的原因发现，来自活动龋患儿的S.mutans菌株对唾液中α-防御素1/2、β-防御素2/3和LL-37的耐药性均显著高于无龋者。

通过上述研究可见，在正常情况下，LL-37联合口腔中多种唾液肽(α-防御素1/2、β-防御素2/3等)对口腔中微生态平衡的调控及致病菌感染的清除起到积极的促进作用，但S.mutans、远缘链球菌等病原体也可以通过产生耐药性变异来逃逸LL-37及其他唾液肽的杀伤，从而定植于牙齿表面形成牙菌斑，造成牙齿的严重龋坏。

2.2牙周病 牙周病指的是发生于牙龈、牙周膜等牙齿支持组织的慢性炎症性疾病。牙周病是常见的口腔疾病，也是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一。牙周病的发病机制复杂，但学者认为，菌斑微生物黏附在牙齿表面后与宿主发生的免疫反应是造成牙周组织病变的主要原因[15]，作为口腔中参与感染免疫的重要抗菌肽，LL-37凭借其抗感染和免疫调节作用，及时有效地识别并杀灭牙周致病微生物，也可以通过中和细菌内毒素减少其对牙周组织的破坏，达到保护牙周组织的目的[16]。目前已有多项研究证实，LL-37与牙周病的发生发展之间存在密切联系[17-21]。

Hosokawa等[17]研究发现无论是否存在炎症，牙龈上皮细胞均可表达β-防御素2/3和LL-37。他们通过免疫组织化学和酶联免疫吸附测定法分析牙龈组织中的唾液肽发现，在牙周炎患者的牙龈炎症组织中，中性粒细胞仅表达LL-37而不产生β-防御素2/3，且相对于健康的牙龈，炎症组织中LL-37的表达水平明显升高，牙周损伤越严重，牙龈缝隙深度越大，而牙龈组织匀浆中LL-37的水平与牙龈缝隙深度呈正相关。

Puklo等[21]利用免疫印迹比较了慢性牙周炎和侵袭性牙周炎患者及健康人群龈沟液样本中LL-37的表达水平，结果发现，慢性牙周炎患者的LL-37水平最高，侵袭性牙周炎患者次之，而健康人群龈沟液中的LL-37多以hCAP-18的前体形式存在；同时，除hCAP-18和LL-37外，在龈沟液样本中还检出另外一种分子量为11 000的蛋白。有研究通过分析LL-37与牙周菌斑中特异致病菌间的关系发现，该分子量为11 000的蛋白条带与牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌和齿垢密螺旋体细菌的蛋白水解酶有关，该酶可降解 hCAP-18，形成分子量为11 000的蛋白[20-21]。

Eick等[22]发现，与正常人相比，掌跖角化-牙周破坏综合征患者更易罹患重度牙周炎，且在掌跖角化-牙周破坏综合征牙周炎患者龈沟液中虽然含有高表达水平的hCAP-18，但LL-37无法检出。这是因为掌跖角化-牙周破坏综合征患者体内存在功能失调的组织蛋白酶C和丝氨酸蛋白酶3，而缺乏丝氨酸蛋白酶3将导致hCAP-18无法被剪切成为成熟的LL-37[23]；在口腔抗菌肽缺乏的情况下，口腔致病菌(如伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌等)较易感染牙龈和牙周组织，最终发展为牙周疾病[24]。

可见，在健康情况下LL-37多以前体hCAP-18的形式存在于各类免疫细胞中，在遭遇感染引起炎症时，以中性粒细胞为主的各类免疫细胞向炎症发生部位迁移，hCAP-18水解形成具有活性的LL-37并释放至炎症发生部位，随着LL-37水平升高发挥抗菌及中和脂多糖毒性的作用，口腔牙周病情况好转，各种炎症反应减轻趋向恢复；但口腔中存在的致病微生物也可以产生蛋白酶水解hCAP-18，使其形成LL-37的量减少，以利于这些致病微生物的定居和侵袭。

2.3口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP) OLP是一种伴有慢性浅表性炎症的黏膜角化异常性疾病，是口腔黏膜病中最常见的疾病之一，目前病因尚不明确，但有数据表明其可能与精神因素、内分泌因素、免疫因素、病原微生物感染因素有关[25-27]。

Davidopoulou等[28]通过酶联免疫吸附测定检测了健康受试者和OLP患者唾液中LL-37的水平，结果发现健康受试者唾液中LL-37的平均水平约为30.5 ng/mL，而网型、糜烂型(轻度)、糜烂型(重度)OLP患者分别为34、64、68.5 ng/mL，显著高于健康受试者，给予皮质激素治疗后患者唾液中LL-37的水平均显著下降，且随着唾液LL-37水平的降低，病灶的临床外观改善。

邹杰[29]采用免疫组织化学技术和逆转录聚合酶链技术检测了25例OLP患者的病变黏膜组织和14例健康个体黏膜组织中的LL-37水平及其信使RNA表达，发现LL-37在健康个体的正常口腔黏膜组织中也有少量表达，但在OLP病损组织中表达量明显升高，提示LL-37可能因炎症诱导而参与OLP的发生发展；且采用酶联免疫吸附测定定量分析OLP患者口腔中LL-37水平，也发现在重度OLP患者唾液中LL-37水平显著高于健康者。

目前已有研究证实，幽门螺杆菌、白色念珠菌等病原微生物的感染与OLP发病关系密切[30]。Hase等[31]研究发现，皮肤以及消化道黏膜在受到幽门螺杆菌、溃疡分枝杆菌等病原微生物刺激时，除中性粒细胞外，上皮细胞也可以通过Toll样受体2/4旁路刺激释放LL-37、β-防御素2/3发挥局部免疫作用。Ren等[32]报道，LL-37在结直肠癌细胞中可通过G蛋白偶联受体-p53-Bcl-2相关X蛋白/Bak/Bcl-2的级联活化，在线粒体膜间蛋白凋亡诱导因子作用下，使核酸内切酶G进入细胞核，引起DNA片段化，促使结直肠癌细胞凋亡，且该凋亡过程并不依赖传统的胱天蛋白酶途径。可见，当口腔内发生幽门螺杆菌、白色念珠菌等病原微生物的感染时，炎症部位趋化的中性粒细胞、局部的黏膜上皮细胞可以通过产生成熟的LL-37去杀灭这些病原体来维护口腔内环境的稳定，但产生LL-37是否可通过非胱天蛋白酶依赖途径介导OLP中基底细胞凋亡从而加重OLP的进一步发展，仍有待研究证实。

LL-37作为机体先天性免疫的重要组成部分，在维系口腔黏膜健康中具有一定的积极作用。但在OLP的发展病理过程中，LL-37表达量明显升高，且在治疗过程中伴随LL-37水平降低，OLP的病灶外观也发生改善，说明LL-37极有可能促进了OLP的发病过程，但具体机制尚未阐明。

2.4口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC) 在世界范围内，口腔肿瘤发病率占所有恶性肿瘤的3%左右，口腔肿瘤中最常见的细胞来源是鳞状细胞，其在口腔肿瘤中占的比例超过90%[33]。

Okumura等[34]研究发现，来自hCAP-18 C端的27肽“hCAP-18109-135”及LL-37可在体外通过非胱天蛋白酶依赖途径诱导OSCC 细胞SAS-H1凋亡，而在健康人牙龈成纤维细胞和人角质形成细胞中并未出现此现象。Li等[35]研究也发现，LL-37的衍生物FK-16在体外实验中对口腔上皮癌敏感细胞株与多药耐药细胞株具有良好的杀伤作用。

Chen等[36]对70个OSCC组织和20个正常组织中的hCAP-18/LL-37进行了免疫组织化学比较，结果发现hCAP-18/LL-37可在正常口腔黏膜中表达，而在OSCC中弱表达，且LL-37的表达水平与肿瘤增殖标志物Ki-67呈负相关。同时该研究还发现，相较正常外周红细胞及人角质形成细胞，OSCC细胞HSC-3/HSC-4中hCAP-18的启动子CpG位点甲基化水平明显升高，给予去甲基化药物5-Aza-CdR处理HSC-3/HSC-4细胞后，细胞中hCAP-18/LL-37的表达水平升高[36]。

在动物实验方面，Açil等[37]将12只裸鼠分组，将人鳞状上皮舌癌细胞SCC-4施用于裸鼠口腔构建OSCC模型，使用LL-37衍生物KI-21-3定期注射。结果发现，实验组的平均肿瘤质量低于对照组；在免疫组织化学分析中，对照组的肿瘤增殖标志物Ki-67达到了Ki-21-3注射组的4倍，实验组肿瘤细胞凋亡率较对照组增加2.5倍。

通过以上研究可知，hCAP-18/LL-37及其衍生物可促使OSCC细胞凋亡，其机制与Ren等[32]在结直肠癌中观察到的作用一致。作为固有免疫的重要组成部分，hCAP-18/LL-37及其衍生物在OSCC的发展过程中起重要的抑癌作用，但在OSCC患者体内，癌细胞也可以通过提高hCAP18启动子甲基化水平的方式来限制LL-37的表达，从而促进OSCC的发生和发展。

3 小 结

LL-37在维系口腔健康方面发挥重要作用，其在龋齿、牙周病及OLP患者口腔中的表达上调，而在OSCC患者中下调；LL-37可通过影响S.mutans的吸附减少牙菌斑的形成，从而减少龋坏，也可以在口腔中发挥抗菌及中和脂多糖的作用来缓解牙周炎症，且通过非胱天蛋白酶依赖途径诱导OSCC 细胞凋亡。这些研究结果均证实，LL-37与这些口腔疾病的发生和发展存在密切联系。但目前对LL-37在口腔健康方面的研究开展并不充分，很多研究仍停留在临床样本分析和体外实验阶段。而口腔溃疡病、口臭、坏疽性口腔炎等疾病与LL-37之间是否相关、具体机制仍有待进一步研究。随着人们对LL-37研究的不断深入，LL-37将为口腔疾病的发病机制和临床治疗研究开辟新思路。