基于全基因组测序技术的早期及晚期稽留流产遗传学分析

陈惠英，范舒舒，许红雁，彭红梅，张 浔，黄笑英

(粤北人民医院 1.生殖遗传中心；2.妇产科，广东 韶关 512000)

稽留流产指妊娠不足28周、胎儿体质量不足1 000g，胚胎发育自然终止(包括胎心消失及无胚芽、无胎心)但未排出宫腔，其是自然流产前的病理性过程[1]。稽留流产在我国发生率为13%，且有上升趋势。稽留流产的发生与遗传、环境、子宫畸形、免疫、内分泌等多种因素相关，其中，遗传因素尤其是染色体异常占60%[2]。稽留流产的绒毛/胎儿组织染色体检查有助于查找其原因，对再生育的优生遗传咨询有积极的应用价值。随着全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)技术的发展，鉴于通量高、精确、报告周期短等特点，在临床上的应用得到不断推广[3]。本研究主要应用WGS技术对早期及晚期稽留流产绒毛/胎儿组织进行遗传学分析，探讨稽留流产发生的遗传学原因。

1资料与方法

1.1研究对象

对2018年9月至2019年10月在粤北人民医院妇产科就诊的188例稽留流产绒毛/胎儿组织进行染色体检查，

选取2018年9月至2019年10月在粤北人民医院妇产科就诊，超声确诊为胚胎停止发育/胎死宫内，排除孕期感染等原因，采用WGS技术查找稽留流产原因的患者共188例，患者年龄为21～46岁，孕龄为6～27+6周。检测前，患者知情同意并签字。

1.2检测方法

1.2.1取样

小孕周无法取得胎儿组织时，取约10mg绒毛组织样本；可见胎儿组织时，取约1cm×1cm胎儿组织样本。使用生理盐水多次漂洗样本，去除污染物后放至无菌标本专用瓶内冷冻保存；使用EDTA真空采血管，采集母体外周血全血2mL，用于做STR基因分析，以鉴别母源性污染，提取的绒毛/胎儿组织样本及母体全血交由深圳华大临床检验中心检测。

1.2.2检测步骤

①提取DNA：室温下解冻标本，剪碎研磨绒毛/胎儿组织后加入消化液，混匀后离心5min(2 000r/min)，去除上清液后PBS清洗，倒入1.5mL的EP管中，加入200μL Buffer AL震荡混匀，56℃温育10min后瞬时离心，加入200μL无水乙醇混匀，使用过滤柱离心1min(6 000×g)，添加Buffer AW 1 500μL再次离心1min(6 000×g)，添加Buffer AW 2 500μL后离心3min(6 000×g)，拿出过滤柱，加入Buffer AE 50μL后离心1min(6 000×g)；②短串联重复序列分析(short-sequence tandem repeat，STR)技术：排除样本母源细胞污染、检测染色体非整倍体；③WGS技术的检测：采用琼脂糖凝胶电泳分析检测污染情况及DNA的完整性，采用Nanodrop检测DNA的纯度；④文库的构建：经末端修复、接头连接、接头连接产物纯化、PCR反应、PCR产物纯化等步骤，定量检测后进行核酸纳米球制备、Qubit质控，用BGISEQ-500平台进行测序，分辨率为5Mb。运用比对软件对测序数据进行分析，将不同测序序列标签与相应染色体匹配。参考基因组为GRCh37/hg19。

1.3统计学方法

运用SPSS 22.0统计软件分析数据。计数资料采用频数和构成比(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1早期及晚期稽留流产绒毛/胎儿组织染色体异常情况

在188例稽留流产绒毛/胎儿组织中，有182例成功地进行了WGS技术检测，另有6例因DNA降解问题检测失败，检测成功率为96.81%。在182例稽留流产绒毛/胎儿组织中，染色体正常89例，染色体异常93例，异常率为51.10%。稽留流产染色体异常包括数目异常79例(84.95%)、嵌合体10例(10.75%)、染色体片段缺失/重复4例(4.30%)。

按孕周进行分组，早期稽留流产(<12周)138例，染色体异常79例，异常率为57.25%；晚期稽留流产(≥12周)44例，染色体异常14例，异常率为31.82%，两组染色体异常率比较差异有统计学意义(χ2=8.63，P=0.00)。

2.2早期及晚期稽留流产绒毛/胎儿组织染色体异常类型

早期稽留流产染色体数目异常占82.28%(65/79)、嵌合体占12.66%(10/79)、染色体片段缺失/重复占5.06%(4/79)；晚期稽留流产均为染色体数目异常，未见嵌合体及染色体片段缺失/重复，见表1。

表1 182例稽留流产绒毛/胎儿组织WGS检测结果(n)

2.3染色体异常情况分析

在182例稽留流产绒毛/胎儿组织中，染色体异常93例。

在93例染色体数目异常中，三体型56例，X单体12例，多倍体(69，XNN)5例，多重三体异常(48，XN，+5，+21；48，XXY，+18；48，XXY，+13)6例；在10例嵌合体中，16-三体嵌合1例(嵌合比例为58%)，21-三体嵌合1例(嵌合比例为56%)，X单体嵌合6例(嵌合比例分别为78%、74%、59%、21%、39%、57%)，18-三体嵌合2例(嵌合比例分别为61%、70%)；在4例染色体片段缺失/重复中，1例1号染色体长臂重复22.96Mb，1例5号染色体长臂微重复27.44Mb，1例15号染色体长臂缺失7.53Mb，1例16号染色体短臂微缺失23.58Mb。

3讨论

3.1染色体异常为稽留流产的原因

本研究通过WGS技术对稽留流产的绒毛/胎儿组织染色体进行分析，发现染色体异常率高达51.10%，早期稽留流产的染色体异常率为57.25%，晚期稽留流产的染色体异常率为31.82%，早期稽留流产染色体异常率明显高于晚期稽留流产，与相关文献[3-4]报道一致，提示遗传因素为早期稽留流产的主要原因，也是晚期稽留流产的原因之一。因此，早期稽留流产的遗传学原因检查尤为重要，并对优生优育指导有重要意义。对不明原因及有再生育需求的稽留流产者，建议常规检查流产组织的染色体，对绒毛/胎儿组织染色体异常者，必要时需进一步检查父母双方的染色体。

3.2稽留流产以染色体数目异常为主

本研究中，稽留流产绒毛/胎儿组织染色体数目异常比例较高，数目异常占所有染色体异常的84.95%，其中三体型所占的比例最高，主要为2、13、14、15、16、18、20、21、22-三体型，其中22-三体、16-三体、X单体在染色体异常中所占比例较高，这些异常均具有致病性。由于染色体数目异常(非整倍体、单体)及大比例的异常染色体嵌合导致了胚胎无法正常发育而引发流产。16-三体是人类最常见的且被称为致死性胚胎的常染色体三体，是早期稽留流产(<12周)中最常见的染色体异常情况，与相关文献[5]报道基本相符。大部分染色体数目异常均为减数分裂异常所致，多数表现为遗传缺陷大，具有极高的胚胎致死性，多数发生早期流产，仅极少数存活出生[6]。

本研究检测出染色体结构异常4例，染色体片段缺失/重复的片段长度为7.53～27.44Mb。在临床致病性基因组拷贝数变异(copy number variation，CNV)中，涉及大量在线人类孟德尔遗传(online Mendelian inheritance in man，OMMI)基因，包括多种致病性微缺失/微重复综合征，可造成胎儿停止发育、多发畸形、宫内生长迟缓等临床结局[7]。

3.3 WGS技术在稽留流产遗传学原因分析中的优势

临床上有G显带核型分析法、荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization，FISH)等多种检查染色体的技术。G显带核型分析法需要将流产绒毛组织进行细胞培养，可检测出三倍体、平衡易位、倒位及大片段缺失/重复等异常，但分辨率低，对小于10Mb的异常染色体无法检测[8]。荧光原位杂交法分辨率高，但该技术仅对13、16、18、21、22、X和Y这7条染色体的数目进行检测，其无法对整个染色体组进行检测，且有漏诊的可能[9]。由于稽留流产组织陈旧，细胞培养成功率低，常规染色体胚胎往往无法获得准确的结果。WGS技术成熟、检测速度快、分辨率高，且能覆盖全基因组，每次可对几十万到几百万个DNA分子进行序列测定，可以弥补G显带核型分析法和荧光原位杂交法的不足[10]。基于WGS技术的高效、准确，建议对稽留流产绒毛/胎儿组织染色体常规进行WGS检测、查找遗传学原因，为患者提供科学的再生育风险评估指导。