干旱胁迫对不同种源长柄扁桃生理特性的影响

蒋晋豫，施智宝，李 云，刘永华，郝新忠，艾 茹

(1.北京林业大学 林木育种国家工程实验室/生物科学与技术学院，北京 100083；2.陕西省林业科学院 ,西安 710082；3.国家林业草原长柄扁桃工程技术研究中心；4.榆林学院，陕西 榆林 719000)

长柄扁桃(Amygdaluspedunculata)属蔷薇科(Rosaceae)桃属(Amygdalus)多年生落叶灌木，是我国西北地区防风固沙重要木本油料植物，具有较高的药用和观赏价值[1-2]。核仁含油量高达55%，可作为品质优良的食用油,具有抗氧化、降血脂和保护肝脏功能[3]，另外还含有大量的粗蛋白(25%)、苦杏仁苷(4%)和丰富的维生素、18种氨基酸和矿质元素[4]。长柄扁桃油也可制成生物柴油，缓解我国能源短缺的问题，有益于改善环境[5]。由此可见，长柄扁桃的用途多种多样，具有广阔的发展前景及开发潜能。

自然环境变化、人为活动等原因导致全球降水量减少，水资源短缺，生活生产用水面临极大困难，并严重威胁农林业发展，干旱问题已成为全球焦点。与之呼应，植物对干旱胁迫响应机理研究也成为重要课题之一，众多问题有待解决。长柄扁桃为适应干旱、强烈光照、土壤贫瘠等恶劣环境形成了许多旱生特征，但抗旱机理仍不甚清楚，为此，我们在完成长柄扁桃不同种源抗旱性评价基础上，以抗旱性较强的榆林榆阳种源和抗旱性较弱的河北丰宁种源为材料，研究干旱胁迫对2个种源植株叶片渗透调节物质、保护性酶活性等生理生化指标的影响，以期推进濒危资源保护及产业化开发和分子生物学研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用长柄扁桃1 a生幼苗，为2017年自繁实生苗，繁殖所需成熟种子2016年7月下旬分别采集于气候干旱程度较强的陕西省榆林市榆阳区补浪河乡和干旱程度较弱的河北省丰宁县坝上，去除核壳后于2017年 3月8日在位于榆阳区的陕西省林业科学院治沙研究所特色经济林示范基地播种育苗，5月18日选择生长整齐一致的优良植株，移栽于防雨棚中，统一栽培管理，定时定量浇水。栽植时每个种源取 50株长势基本一致的苗，移栽至直径30 cm、深25 cm的塑料桶。桶底斜铺碎石子，上面平铺一层滤纸(防止土壤渗入石子中)。沿桶壁插入一根塑料管(高度超出桶面2～3 cm)作为灌水和通气管道(桶重+石子+滤纸+塑料管=1 kg)。每个桶放入土壤10 kg。最后用珍珠岩覆盖土表抑制水分蒸发。移栽时充分灌水，以保证长柄扁桃幼苗成活。

1.2 试验处理方法

从7月1日起，对两个种源的长柄扁桃盆栽苗进行两种处理，分别为：对照(水分供应正常，保障生长旺盛)和持续干旱胁迫处理即从开始处理到处理结束持续40 d不浇水，利用持续土壤水分蒸发和植物蒸腾延长和加重干旱胁迫。在试验开始第 8、16、24、32和40 d分别采集叶样，用于测定相关生理指标。

1.3 指标测定

1.3.1 土壤含水量测定 从土壤相对含水量达到 45%～50%开始，每隔8 d采样1次，采样时在每盆植物根部附近取原状土样10 g左右并密封，带回实验室采用烘干法测定，每个种源重复3 次。

1.3.2 叶片组织含水量测定 在采集土壤的同时，采集从植株顶部下数第4～5片生长正常、无病虫害和损伤的叶片并密封带回实验室，重复3次；部分叶样及时用于测定含水量，部分叶样存于冰箱冷藏、备用于测定生理指标。

土壤(叶片)绝对含水量R

×100%

1.3.3 植株其它生理指标测定 叶片自由水/束缚水含量利用阿贝折射仪采用马林契克法测定[6]；叶片细胞质膜相对透性(RPMP)采用电导仪法测定[6]；叶片游离脯氨酸含量用磺基水杨酸浸提法测定，叶片丙二醛含量用硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定[6]；叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮蓝四唑法(NBT)测定[6]，叶片过氧化物酶活性用愈创木酚法测定[6]；叶片可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250 法测定[6]。每个指标测定3次即3次重复，取平均值。

1.4 数据分析

采用Excel对原始数据整理及图表制作，采用SPSS14.0 进行显著性分析、权重分析和散点图的绘制。

采用Microsoft Excel和SPSS软件对进行数据整理和分析计算。

2 结果与分析

2.1 各处理土壤绝对含水量随处理时间的变化

从表1看出，处理开始后前8 d土壤含水量处于适宜状态，第9 d开始进入水分胁迫期。根据土壤相对含水量的变化，试验期土壤含水量可分为5个时期，即适宜期(处理后第1～9 d),轻度胁迫期(处理后第10～17 d),中度胁迫期(处理后第18～25 d),重度胁迫期(处理后第26～33 d)和极重度胁迫期(处理后第34～40 d)。

表1 处理后土壤含水量

2.2 干旱胁迫对2个种源长柄扁桃叶片相对含水量的影响

一般而言，土壤含水量与植物叶片相对含水量正相关，即当土壤含水量降低时，植物叶片含水量也会相应下降。如果在干旱胁迫下，叶片仍能保持较高的相对含水量，则其对干旱胁迫有较强的适应性。因此，叶片相对含水量高低在一定程度上可以反映植株抗旱能力的强弱[7]。

本研究中，2个种源长柄扁桃叶片相对含水量都随着胁迫程度的加剧呈下降趋势，而正常灌水苗木(对照)叶片相对含水量变化不大(图1)。当胁迫后第8 d，榆林榆阳种源与河北丰宁种源的长柄扁桃叶片相对含水量都开始快速下降，下降幅度分别为10.99%和32.58%，至干旱胁迫第40 d时，2个种源的叶片相对含水量均降至各自的最低，分别为32.97%和55.06%，榆阳种源叶片含水量高于丰宁种源，说明榆林榆阳种源叶片对干旱胁迫自身调节的能力强于河北丰宁种源。

图中F为河北丰宁种源，Y为榆林榆阳种源，CK为对照，下同。

2.3 干旱胁迫对2个种源长柄扁桃幼苗叶片质膜透性和丙二醛含量的影响

2.3.1 叶片质膜透性 从图2可见，长柄扁桃叶片质膜相对透性随着干旱胁迫的加剧呈上升趋势，而正常灌水苗木对照组叶片质膜透性变化不大。在最初胁迫时上升缓慢，在胁迫24 d后急剧上升。其中河北丰宁种源(F)的质膜相对透性增幅相对较大，胁迫第32 d比第24 d增大48.05%，说明其细胞膜被破坏程度较大；而榆林榆阳种源(Y)的质膜透性变化幅度较小，说明其细胞受干旱胁迫的影响小。

图2 2个种源长柄扁桃叶片质膜透性

2.3.2 叶片丙二醛含量 随着干旱胁迫时间的增加，长柄扁桃两个种源丙二醛含量总体呈增加趋势，但动态变化略有不同(图3)，而正常灌水苗木对照组丙二醛含量变化不大。长柄扁桃两个种源MDA的含量在胁迫第16 d后就开始急剧上升，河北丰宁种源、榆林榆阳种源比胁迫开始时上升了46.15%和28.00%，对干旱的敏感度较质膜透性大,并且在胁迫后期河北丰宁种源(F)MDA含量远远高于榆林榆阳种源Y，这说明其生物膜受损程度和发生膜脂过氧化作用的程度较严重。

图3 2个种源长柄扁桃叶片MDA含量

2.4 干旱胁迫对渗透调节物质脯氨酸和可溶性蛋白的影响

2.4.1 脯氨酸 从图4可看出，当长柄扁桃受到干旱胁迫后两个种源Pro含量整体呈先达到高峰，正常灌水苗木对照组Pro含量变化较小，说明其对干旱胁迫比较敏感，能尽快产生Pro调节细胞质溶液与环境的渗透平衡，在胁迫40 d时呈下降趋势，较32 d相比，河北丰宁、榆林榆阳种源分别下降了24.3%和20.8%，说明两个种源长柄扁桃干旱胁迫程度已经超过了Pro的调节能力。

图4 2个种源长柄扁桃叶片脯氨酸含量

2.4.2 干旱胁迫对两个种源长柄扁桃可溶性蛋白的影响 从图5可以看出，可溶性蛋白含量在胁迫到32 d时下降幅度比较明显，与第24 d相比，河北丰宁、榆林榆阳种源分别下降了37.64%、14.01%，正常灌水对照组中可溶性蛋白含量变化不大。说明在可溶性蛋白含量指标方面，榆林榆阳种源的抗旱性强于河北丰宁种源。

图5 2个种源长柄扁桃叶片可溶性蛋白含量

2.5 干旱胁迫对2个种源长柄扁桃细胞内保护酶系统的影响

2.5.1 叶片SOD含量 从图6可以看出，两个种源长柄扁桃的SOD含量都是随着胁迫时间的延长呈现出先升高后降低的趋势，但是正常灌水苗木对照组SOD含量几乎没有明显变化。长柄扁桃两个种源均在第24 d时达到高峰值，河北丰宁种源和榆林榆阳种源SOD含量分别为794 U·g-1·min-1和959 U·g-1·min-1，在整个胁迫过程中SOD含量差异显著。而河北丰宁的SOD含量一直较小，说明其清除自由基的能力较弱，抵抗干旱破坏的能力较差。

图6 2个种源长柄扁桃叶片SOD含量

2.5.2 叶片POD含量 从图7可以看出，两个种源长柄扁桃的POD含量都是随着胁迫时间的延长呈现出先升高后降低的趋势，而对照组苗木POD含量变化不大。两个种源长柄扁桃POD在第32 d时才达到高峰值，河北丰宁种源和榆林榆阳种源POD含量分别为8.9 U·g-1·min-1和10.1 U·g-1·min-1，POD含量较少，说明其清除自由基的能力较弱，抵抗干旱破坏的能力较差。

图7 2个种源长柄扁桃叶片POD含量

3 讨论与结论

3.1 讨论

榆林榆阳种源长柄扁桃长期生长在干旱的沙地环境中，必然进化出适应这种干旱环境的生理生化以及分子机制。本试验研究发现，干旱胁迫会使长柄扁桃叶片内组织相对含水量下降，在饱和亏持续上升土壤中度水分胁迫以上能维持较高水平。在处理后第8～40 d的胁迫处理下，脯氨酸含量随胁迫浓度的增加以及胁迫时间的延长持续增加，与可溶性蛋白相比脯氨酸积累的速度以及幅度更快。在土壤干旱胁迫下，随土壤相对含水量的减少，脯氨酸含量逐步增加而后减少，蛋白质含量持续下降。这说明河北丰宁长柄扁桃在逆境下生成蛋白质的能力相对较弱，这与郭改改等的研究结果一致[8]。第16 d的时候总叶绿素含量大幅度的升至最高，说明在干旱胁迫程度较轻时，长柄扁桃通过增强光合色素的含量来缓解外界干旱环境的胁迫，但随时间的延长胁迫强度增大时，长柄扁桃的这种缓解能力下降。

3.1.1 干旱胁迫对叶片相对含水量(LRWC)、细胞膜透性以及MDA的影响 在干旱胁迫刚发生时，叶片相对含水量(LRWC)下降缓慢是因为在轻度胁迫下，植物通过自身调节水分吸收和消耗来满足LRWC的平衡，从而限制光合速率等其他机能，同时若能维持较高的LRWC且下降越慢，表明植株的叶片持水力越强，抗旱性越强，常被用作衡量植株抗旱性的生理指标。本研究中榆林榆阳种源的叶片相对含水量在胁迫过程中一直处于较高水平，且下降缓慢，说明榆阳种源(Y)的长柄扁桃叶片具有较高的持水力，而河北丰宁种源(F)的长柄扁桃叶片则相反，说明其持水力弱，不能抵御干旱不良环境。LRWC变化的同时首先引起膜透性改变，膜上酶蛋白的变化和脂类组成都有所改变，同时各种代谢失去平衡，活性氧积累，发生膜脂过氧化，破坏膜的正常功能，而且过氧化产物MDA极其类似物也能直接对植物细胞起毒害作用。因此叶片相对含水量，质膜透性和MDA含量都可直接用来衡量植物的抗旱能力。

3.1.2 干旱胁迫对渗透调节物质及保护酶的影响 在干旱胁迫的影响下，生理过程的变化并非同时发生，一般认为抗氧化系统对胁迫等非生物因素的反应比较敏感。本研究中，榆林榆阳种源长柄扁桃叶片SOD和POD活性在整个胁迫过程中均处于最高水平，说明其有良好的旱害防御系统，而SOD活性在第24 d时先达到峰值，说明SOD保护酶系统较POD先受到损坏，POD在较严重的旱害条件下也能发挥较好的抗氧化能力，但是在胁迫后期SOD和POD活性均降低，不足以清除体内的自由基，引起膜脂过氧化作用，增加了植物的受害程度。由此分析可得出，榆林榆阳种源的长柄扁桃有较强的抗旱能力。一般植物在干旱胁迫下体内脯氨酸和可溶性蛋白的含量显著增加，且抗旱性强的植物积累的脯氨酸和可溶性蛋白明显高于不抗旱的植物。本研究中两个种源长柄扁桃随着胁迫的加剧游离脯氨酸呈先上升后下降的趋势，且榆阳种源的Pro含量明显高于其他种源，说明其的抗旱性最强；可溶性蛋白含量则随干旱的加重而下降。可溶性蛋白含量下降，可能与初生代谢受到抑制使可溶性蛋白质合成受阻，降解加快有关，并且根据植物在受到干旱胁迫后蛋白质合成能维持在比较稳定的水平，变化幅度较小者抗旱性强,可以得出两个种源长柄扁桃的抗旱性由强到弱的顺序与对细胞膜透性和MDA研究得出的结果一致。

3.2 结论

长柄扁桃的抗旱抗逆性是其生理生化状态、结构等共同协调高度契合的结果。本试验的榆林榆阳种源和河北丰宁种源长柄扁桃1 a生实生幼苗在轻度、中度、重度土壤水分胁迫下生理生化影响研究结论为，2个种源长柄扁桃在遭受土壤轻度胁迫时，叶片保护酶活性显著提高，丙二醛含量、脯氨酸和可溶性蛋白能维持良好的协调关系，这几种物质协同在前期轻度胁迫时起到了重要作用，从而在轻度胁迫时增强了其抗旱的能力。但在中度、重度、极重度胁迫时植株体内保护酶和其他物质的合协关系可能被打破，说明植株抗旱机理较弱，导致最后这几种物质代谢紊乱，中度、重度胁迫时植株开始出现不正常的病态反应。