补肾活血复方对心肌梗死后心力衰竭大鼠CaMKⅡ的影响研究*

徐 瑶，张 艳，孔繁达 ，张 伟

1.辽宁中医药大学(沈阳 110847)；2.辽宁中医药大学附属医院(沈阳 110032)

慢性心衰近年来发病率明显升高，在中国30～75岁的人群中，有近400万人患有心力衰竭，5年内死亡率超过65%，其中慢性心衰患者占主要比例[1]。神经内分泌激活加快心衰的进程，心肌重构是慢性心衰发生发展的基本机制，因此阻断神经内分泌激活，抑制心肌重构成为治疗心衰的关键。多项研究证实β-肾上腺素能系统和α肾上腺系统可以通过增加细胞内Ca2+浓度并与CaM结合，之后经过活化CaMKⅡ，介导心肌肥厚和凋亡产生，致使心脏衰竭发生[2]。心肌细胞凋亡及心室重构等信号通路均受到CaMKⅡ的调节。团队前期大量研究证实补肾活血复方能降低心衰大鼠血浆OPN、Klotho蛋白水平，还能改善大鼠的症状和心肌细胞功能[3-4]。本次实验将进一步探讨补肾活血复方对心梗后心衰大鼠心功能及心肌中CaMKⅡ表达的影响。

材料与方法

1 实验材料

1.1 药物:补益心肾中药，主要成分为：黄精、坤草各20 g，桂枝、红花各15 g，黄芪40 g，丹参30 g，人参10 g，三七5 g，选自辽宁中医药大学附属医院药剂中心煎制。卡托普利片：25 mg×100片，购自上海旭东海普药业有限公司(国药准字H31020564)。

1.2 动物:SPF级雄性Wister大鼠80只，体重(200±20)g，购买于辽宁长生生物技术有限公司，SCXK(辽)2015-0001。

1.3 动物饲养环境:温度(23±2)℃，湿度适宜，明暗交替，噪声<50分贝，定期饲喂饮水，垫料1周替换3次。

1.4 仪器设备与试剂盒：仪器设备有自动组织脱水机(河北慧采科技开发有限公司，型号RL078536KD-TS3D1)，切片机(日本日立公司，型号Leica RM2015)，摊烤片一体机(德国SLEE医疗有限公司，型号Slidetec WATER/HETA)，电热恒温箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)，显微镜(日本奥林巴斯公司，型号OlympusBX51)。

试剂盒：CaMK Ⅱ一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，二抗酶标山羊抗小鼠/ IgG聚合物(北京中杉金桥)，蛋白酶K(Solarbio),DAB显色试剂盒(脉新试剂)，Elisa试剂盒(英国Abcam公司，型号ab108816),二甲苯、酒精、苏木素、PBS等。

2 实验方法

2.1 慢性心衰大鼠造模:①大鼠适应性喂养1周后，随机选出20只为假手术组，只挂线不结扎。剩余60只经冠脉结扎，术后给予减食和力竭式游泳造模，随机分为模型组、西药组、中药组。②在禁食和给水12 h后捕获大鼠，并且腹膜内注射10%水合氯醛(剂量0.3～0.5 ml/100 g)。麻醉后，将大鼠固定在手术台上，准备胸部皮肤，连接心电图仪器，记录大鼠术前心电图。调整动物呼吸机数值，打开开关备用。大鼠经喉气管插管，气道畅通后，接通小动物呼吸机。③稳定呼吸后，大鼠接受开胸手术。碘酊消毒，在胸部第四肋间纵行开口，胸肌直接分离，钩开肋间，用小镊子撕裂心包膜，助手施力并抬高心脏使心脏完全显露，用6号手术线在左冠状动脉开口以下2 mm进行结扎[5-6]，肋间隙等组织层用3号线迅速缝住，以结扎完ECG标准肢体二导联 ST 段抬升(≥0.1 mV)作为结扎成功的标准[7]。④大鼠腹腔注射青霉素钠50000 U每天，连续7 d。存活大鼠常规饲养1周，第2周起饲料减到原喂养量一半，每天进行一次力竭游泳(力竭标准以大鼠头部持续没入水里3 s以上，四肢无力活动)，持续4周。造模结束后，用彩色多普勒超声心动图检查大鼠，射血分数≤50%或心脏指数≤180 ml/(min·kg)，认为造模成功[8-9]，本次实验造模前后大鼠心脏彩超对比(图1、2)。

图1 大鼠造模前心脏彩超

图2 大鼠造模后心脏彩超

2.2 分组与药物治疗:假手术组死亡3只，剩余17只。其余60只造模成功的37只,随机分为西药组(13只)，中药组(12只)和模型组(12只)。正常、模型两组大鼠不用药，只灌服常规等体积蒸馏水，3 ml/次，每日1次；阳性药物组参照人鼠剂量转换公式用药干预，西药组卡托普利片灌服，12.5 mg/(kg·d)；中药组大鼠灌服补肾活血复方制剂，剂量为9.2 g/(kg·d)(初步实验显示中药制剂等效剂量效果最好，因此采用等效剂量换算)，连续用药4周。

2.3 收取标本:大鼠均麻醉，腹主动脉采血，处死取心脏固定。

酶联免疫法测定大鼠血BNP表达：①设有样本孔、标准品孔及空白孔。样本孔加入待测样本10 μl后，再加其稀释液40 μl；不同浓度的50 μl稀释标准品加入标准品孔中；不添加空白孔；②将100 μl HRP标记抗体分别加入样品孔和标准样品孔中，置37 ℃水浴中孵育60 min。丢弃孔中液体，轻拍吸水纸，向每个孔中加入洗涤液，静置1 min，扔掉洗涤液，于吸水纸上轻拍，反复洗板5次；③在各孔中加入50 μl底物A和50 μl B，37 ℃遮光孵育15 min，最终滴入50 μl终止液，在15 min内，于波长450 nm处测得各孔的OD值。

免疫组织化学法检测大鼠心肌中CaMKⅡ的表达：①大鼠心肌标本用4%多聚甲醛液固定，然后包埋于石蜡中并切片；②脱蜡后PBS冲洗，蛋白酶K进行抗原修复，先后加入内源性过氧化物酶及10%胎牛血清封闭，一抗培养过夜，用PBS洗涤，加入酶标记的山羊抗小鼠或兔IgG聚合物，常温孵育后，DAB染色，苏木素复染，脱水透明后封片；③在切片中选取5个高倍视野，用Image J对视野灰度值进行分析，并用平均值表示。

3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件来分析，测量数据以均数±标准差表示，用单因素方差分析进行比较，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 四组大鼠一般情况对比 成模后，除假手术组，其余各组大鼠毛色暗沉、偶有脱毛，精神疲乏，运动量减少，饮食略差，体重下降，一些大鼠出现咳嗽、气短的症状；给药干预后，西药组和中药组大鼠毛色渐有光泽，精神状态好转，活动、饮食、体重都出现增长，咳嗽气短减轻。

2 四组大鼠心脏彩色多普勒超声结果对比 见表1。治疗4周后，与假手术组相较，模型组LVEDD、LVESD显著升高，EF和FS均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，西药组、中药组LVEDD、LVESD显著降低，EF、FS显著升高(P<0.05)；与西药组相比，中药组LVEDD、LVESD、 EF、FS比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 四组大鼠心脏彩色多普勒超声结果对比

3 四组大鼠血清BNP水平比较 见表2。用药4周后，与假手术组相比，模型组血清BNP表达水平显著增高(P<0.05)；与模型组比较，中药组和西药组血清BNP表达水平明显低于模型组(P<0.05)；与西药组相比，中药组血清BNP表达水平变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 四组大鼠血清BNP水平比较(ng/ml)

4 四组大鼠心肌组织CaMKⅡ平均灰度值比较见表3。用药4周后与假手术组比较，模型组CaMKⅡ平均灰度值升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，中药组、西药心肌组织中CaMKⅡ平均灰度值降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与西药组相较，CaMKⅡ平均灰度值在中药组的表达相差不大，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 四组大鼠心肌组织CaMKⅡ平均灰度值比较

讨 论

慢性心衰为各种心血管疾病的终末阶段，预后较差、致病死率较高，是我国医学亟需解决的难题[10]。其实质是神经内分泌细胞因子的长期、慢性激活导致心肌损伤及心功能恶化，进一步加速心室重塑，而后者又可激活神经内分泌因子系统，形成恶性循环[11]。因此阻止神经内分泌激活与心室重构的交替发生，是目前治疗慢性心衰的关键[12]。

近年来，多项研究证实CaMKⅡ作用于多种信号通路的下游靶点，导致心血管疾病的发生发展[13-14]。CaMKⅡ与心肌肥厚和心力衰竭密切相关。CaMKⅡ参与慢性心衰主要以抑制心肌重构为关键。细胞内Ca2+离子的稳态与调节也受到其活性的影响。当心肌长期损伤激活交感神经系统的兴奋性，导致Ca2+释放增加，与Cam(蛋白激酶)结合形成复合体，就会通过经典Ca2+/Cam依赖途径激活CaMKⅡ的活性，致使细胞凋亡和心力衰竭的发生。越来越多的研究表明CaMKⅡ抑制有利于改善心肌功能。因此，CaMKⅡ活性的调节对于治疗心力衰竭的发展至关重要[15]。

祖国医学对于慢性心衰的认识主要从心肾论治。中医认为心主血脉，肾主藏精，精血同源，相互滋生，精神互用，君相安位[16]。如果心肾功能失衡，就会相互累及，久而久之，心血运行不畅，肾化气利湿失职，血瘀、痰饮内滞，脉道阻塞，发生心衰[17]。补肾活血复方主要功效为补肾益精、活血利尿，是导师张艳教授临床辨治慢性心衰经验方[18]。其中黄精补肾气，益精髓，桂枝温经助阳通脉，黄芪、人参、坤草三味补气血、利水行，丹参、红花、三七活血散瘀，诸药共同发挥补肾益精、活血行水、心肾同治的作用。

本实验应用补肾活血复方对慢性心衰大鼠进行干预，同时观察对其心功能及CaMKⅡ表达的影响，结果显示补肾活血复方能显著升高EF及FS，降低LVEDD、LVESD，改善心功能，且有效抑制心衰大鼠心肌中CaMKⅡ的表达含量，与西药组相较，差异无统计学意义，说明补肾活血中药治疗心力衰竭的疗效与卡托普利相当，提示补肾活血复方能有效治疗心衰。证明以心肾相关理论干预慢性心衰方向明确，为中医药治疗慢性心衰以CaMKⅡ作为新靶点提供依据。