嗜热链球菌MN-ZLW-002促Bb12生长及其机理初步研究

康小红，李周勇，陈建国，韩雪，张兰威，3

（1.哈尔滨工业大学化工与化学工程学院，哈尔滨150090；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，呼和浩特011500；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

0 引 言

嗜热链球菌MN-ZLW-002是一株高产胞外多糖的发酵菌株，菌种保藏号为CGMCC No.3817[1]，该菌株不仅具备作为发酵剂的良好特征，而且通过前期的探索试验，我们还发现MN-ZLW-002可以促进共生菌的生长。双歧乳杆菌Bb12于2007年通过我国卫生部安全性评估[2]，已证实具有调节人体肠道菌群和提高人体免疫力的功效[3]，此后被广泛添加于乳制品中。随着我国乳制品行业市场规模的逐渐扩大，对Bb12益生菌的需求量也在逐年递增，伴随Bb12广泛应用的是菌种成本的不断增加[4]。因此，试验对嗜热链球菌MN-ZLW-002体外促Bb12生长作用进行了研究，通过对比MRS液体培养基和发酵乳中Bb12活菌数的变化以及酸奶的感官测评，确定嗜热链球菌MN-ZLW-002与Bb12最佳的应用复配比例。同时，从培养基中溶氧值的变化情况及MN-ZLW-002发酵产胞外多糖含量的角度对相关机理进行了初步研究[5]，为嗜热链球菌MN-ZLW-002的工业化应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

嗜热链球菌MN-ZLW-002，蒙牛提供；乳双歧杆菌Bb12，科汉森；商业发酵剂L903，科汉森提供。

脱脂乳粉，雀巢；鲜牛乳，蒙牛现代牧厂；MN-ZLW-002菌株胞外多糖（粗提物）；蔗糖、氢氧化钠；M 17琼脂培养基、MRS液体培养基、MRS琼脂培养基、TPY琼脂培养基，均由北京陆桥提供；其它化学试剂均为分析纯。

1.2 试验设备

2000237电热恒温培养箱，西班牙J.P.SELECTA公司；ALPHA 1-4 LD plus真空冷冻干燥机，德国Christ公司；BioStatB生物发酵罐，德国贝朗公司；G560E漩涡混合器，美国SCIENTIFIC Instruments公司；Premium U 410超低温冰箱，美国NBS公司；PB-10 pH计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；CP21GⅡ高速冷冻离心机，日立公司；ML51生物显微镜，日本Olympus公司；SVE-6A1超净工作台，新加坡ESCO公司；Handylab multi12溶氧仪，德国SCHOTT Instruments公司。

1.3 试验方法

1.3.1 MN-ZLW-002在MRS液体培养基中对Bb12生长的影响

冻存的嗜热链球菌MN-ZLW-002经常温下复温2 h后，接种于M 17液体培养基，乳双歧杆菌Bb12接种于TPY液体培养基[6]，两菌株均于37℃条件培养18～24 h，2%接种量活化两代，分别对活化好的MN-ZLW-002和Bb12进行菌落计数。随后，将活化好的MN-ZLW-002及Bb12进行复配，复配菌及Bb12单菌分别接种于MRS液体培养基中，按预试验结果调整MN-ZLW-002和Bb12最终浓度为106和104CFU/mL，37℃进行培养，在培养的第8、16、24 h对混合发酵的Bb12和单独发酵的Bb12进行采样计数[7]。试验共进行三批次实验，每批次实验采集数据三次（n=3），试验分组如下。

表1 试验分组及接菌量

1.3.2 MN-ZLW-002在发酵乳中促Bb12生长研究

试验先将商业化酸奶发酵剂L903及双歧杆菌Bb12按固定接菌量接入已灭菌的鲜牛乳中，并以不同接菌量接入MN-ZLW-002单菌株，于43℃发酵，发酵终点p H控制为4.50，待到发酵终点后将酸奶破乳打冷，经后熟12 h后于4℃条件下贮藏[8]。通过对过程中酸奶的发酵特性及酸奶样品的感官属性进行对比[9]，研究MN-ZLW-002与Bb12的最佳复配比例。通过发酵后及21 d贮藏期间双歧杆菌活菌数的变化，研究MN-ZLW-002菌株在发酵乳中对乳双歧杆菌Bb12生长的影响。具体试验组别及接菌量见表2。

表2 不同试验组别及接菌量

1.3.3 溶氧值对MN-ZLW-002与Bb12共生关系的影响

MN-ZLW-002菌株对培养基及发酵乳中双歧杆菌存活性影响试验表明，MN-ZLW-002菌株对酸奶中的双歧杆菌Bb12具有一定的促生长作用，MN-ZLW-002菌株属于兼性厌氧菌，双歧杆菌为厌氧菌[10]，试验拟从发酵过程中培养基溶氧值变化的角度初步探索该现象的原因[11]。

分别利用乳双歧杆菌Bb12单菌发酵及Bb12与MN-ZLW-002混合发酵12%脱脂乳，Bb12接菌量为50 g/t，MN-ZLW-002与Bb12按上一步试验确定的最佳比例复配，发酵温度为43℃，发酵时间24 h，对发酵过程中酸奶的pH值、溶氧值以及球杆菌数进行采集，分析溶氧值对MN-ZLW-002与Bb12共生关系的影响。

1.3.4 MN-ZLW-002胞外多糖对Bb12的影响

嗜热链球菌MN-ZLW-002是一株高产胞外多糖的菌株[12]，称取MN-ZLW-002菌株发酵脱脂乳的胞外多糖粗提物于MRS液体培养基中，最终制得胞外多糖-MRS液体培养基，并使胞外多糖终浓度为160 mg/L，115℃高压灭菌15 min，备用。

将Bb12菌株活化3代后（37℃厌氧培养18 h），接入胞外多糖-MRS液体培养基及普通MRS液体培养基，接菌量均为1×106CFU/mL（模拟实际生产接菌量），于37℃厌氧培养，在培养的第0、2、4、8、16、24 h取样计数，分析MN-ZLW-002代谢产生的胞外多糖对Bb12生长的影响。

1.3.5 其它指标测定方法

（1）发酵时间[13]

采用乳品发酵监控仪连续测定样品pH值，以0.5 h为最小单位，记录样品p H值降低到4.50所用的时间，即为样品发酵时间。

（2）活菌数测定[14]

按GB4789.35采用MC琼脂培养基对嗜热链球菌MN-ZLW-002进行活菌计数（37℃需氧培养72 h，记录菌落数）；按GB4789.35采用莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基对乳双歧杆菌Bb12进行活菌计数（37℃厌氧培养72 h，记录菌落数）。

（3）黏度测定[15]

黏稠度的测定采用LVDV-Ⅱ旋转式黏度计进行，通过前期预试验，选择62号转子，50 rpm，在4℃条件下，测定10 s计数。照此方法重复测量3次取平均值，黏稠度单位为mPa·s。

（4）酸奶感官测评

由20名蒙牛集团研发中心感官品评小组成员，对发酵乳样品的总体感官（包括色泽、口感及滋气味等）进行评价。总分高于90的，为优质酸奶；总分介于80至90之间的，为良质酸奶；总分低于80的，为次质酸奶。酸奶感官评定标准如下表所示。

表3 酸奶感官评定标准[16]

2 结果与分析

2.1 嗜热链球菌MN-ZLW-002对培养基中Bb12存活率的影响实验

试验将MN-ZLW-002和Bb12的复配菌及Bb12单菌分别接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养，分别在培养的第8、16及24 h对混合发酵样品中的Bb12和单独发酵样品的Bb12进行采样计数。试验结果如表4所示。

表4 Bb12菌落计对数值及t检验结果

由表4可见，Bb12与MN-ZLW-002混合培养8 h的Bb12菌落数对数值小于Bb12单独培养菌落数对数值，差异极显著（P＜0.01）；Bb12与MN-ZLW-002混合培养16 h及24 h的Bb12菌落数对数值与Bb12单独培养菌落数对数值相比较，混合培养的值均大于对应时间的单独发酵的值，其中8 h差异显著（P＜0.05），24 h且差异极显著（P＜0.01）。

图1 Bb12菌落计数结果

以上试验结果表明，MN-ZLW-002有促进Bb12增殖的作用，在混合培养8 h时两株菌处于竞争生长状态，故混合培养Bb12菌落对数值小于单独培养[17]，此后的16～24 h混合培养的Bb12菌落计数迅速提高，且显著高于单独培养的Bb12菌落对数值，说明MNZLW-002对Bb12的增殖产生了有效的促进作用。

2.2 MN-ZLW-002菌株对发酵乳中双歧杆菌生长的影响

2.2.1 MN-ZLW-002对酸奶发酵特征及感官特征的影响

试验在商业发酵剂L903及双歧杆菌Bb12按固定接菌量接入灭菌鲜牛乳的基础上，接入不同比例的MN-ZLW-002单菌株，于43℃发酵，通过对过程中酸奶的发酵特征进行对比监测，以及对酸奶样品进行感官测评，研究MN-ZLW-002与Bb12的最佳复配比例。试验结果如表5所示。

表5 MN-ZLW-002不同接菌量酸奶的发酵特征

表6 发酵乳样品感官测评结果

由以上试验结果可知，各实验组酸奶样品发酵时间基本维持在4 h，仅样品3即MN-ZLW-002与Bb12按1∶100复配组酸奶样品发酵较慢，为4.5 h。各试验组酸奶经后熟12 h后，样品后熟p H值与对照组相比无明显差异；各试验组样品后熟黏度均明显提高，与对照组相比差异显著，表明嗜热链球菌MN-ZLW-002具有明显的产黏特性，可显著提高产品的黏稠度。后酸方面，各组酸奶在4℃条件下贮藏21 d后，1∶10组（试验组4）pH值变化最大，其次为1∶100组（试验组3），均与对照组差异显著，其余组与对照组相比无明显差异，表明过量的MN-ZLW-002添加会造成产品后酸过高。

感官测评方面，各组酸奶样品均呈现出均匀的乳白色，有明显的自然光泽。添加MN-ZLW-002菌株的酸奶后熟黏稠度均高于对照组，品尝结果显示试验组3及试验组4口感过于黏稠，且有明显的酸感。感官测评总分表明，适当少量的添加MN-ZLW-002不会对产品的质构产生不利影响，黏稠度的适当提高反而有利于产品口感，表现为试验组1和试验组2感官总分与对照相比略有提高，但差异不显著。当MN-ZLW-002添加量过多时，产品黏稠度过高，酸感过强，不利于产品质构和口感。试验结果表明，当MN-ZLW-002与Bb12按1×105和1∶1×103复配时，酸奶的发酵特征不受影响，且酸奶的组织状态和口感略有提升。

2.2.2 发酵酸奶贮藏期内Bb12生长情况

各试验组酸奶样品经发酵后熟后，于4℃条件下进行21 d货架期贮藏，通过观察各组酸奶样品中乳双歧杆菌Bb12的活菌数变化，分析MN-ZLW-002菌株在发酵乳中对乳双歧杆菌Bb12生长的影响。试验结果如表7所示。

表7 发酵酸奶贮存期双歧杆菌活菌数对数值

由表7我们可以看到，以不同接菌量接入MN-ZLW-002菌株后，对酸奶中的乳双歧杆菌Bb12均有显著的促增殖作用，其中MN-ZLW-002与Bb12为1∶10（试验组4）的促增殖作用最好，Bb12的活菌数最高，且酸奶于4℃条件下贮藏21 d的双歧杆菌活菌数一直保持在108CFU/mL，比对照组高一个数量级；当MN-ZLW-002与Bb12为1∶100（试验组3）和1∶1000（试验组2）时，发酵酸奶于4℃条件下贮藏14 d内双歧杆菌活菌数一直保持在108CFU/mL，虽然在第21 d时双歧杆菌活菌数降低到107CFU/mL，但是整体数量仍显著高于对照组（P＜0.05）；当MN-ZLW-002与Bb12为1∶1×105（试验组1）时，酸奶自贮藏期7 d后，双歧杆菌活菌数与对照组相比无明显差异。

综合分析MN-ZLW-002不同接菌量的酸奶发酵特性、后酸水平、感官属性及贮藏期内乳双歧杆菌Bb12的活菌数变化情况，我们得出以下结论，当MN-ZLW-002与Bb12以1∶10添加发酵时，具有更好的双歧杆菌促增殖作用，但是发酵酸奶黏稠度过高，后酸比较严重，有待进一步研究改善。当MN-ZLW-002与Bb12添加比例为1∶1×103时产品质量与对照无明显差异，且双歧杆菌活菌数显著高于对 照 组（P＜0.05）。结 果 提 示 我 们，利 用MN-ZLW-002菌株对乳双歧杆菌Bb12的促生长作用，少量添加MN-ZLW-002或可减少Bb12的初始接菌量，降低相关酸奶产品的双歧杆菌成本。

2.3 溶氧实验结果

试验从发酵过程中培养基溶氧值变化的角度初步探索MN-ZLW-002菌株对酸奶中乳双歧杆菌Bb12的促生长作用机理。分别利用乳双歧杆菌Bb12单菌发酵及Bb12与MN-ZLW-002混合发酵12%脱脂乳，Bb12接菌量为50 g/t，MN-ZLW-002与Bb12按1∶1×103复配，43℃发酵24 h，对发酵过程中酸奶的pH值、溶氧值以及球杆菌数进行采集，分析溶氧值对MN-ZLW-002与Bb12共生关系的影响，试验结果如表8。

由表8可见，在混合培养的样品中，嗜热链球菌MN-ZLW-002生长迅速，活菌数于4.5 h即达到108CFU/mL，脱脂乳的溶氧值也于4.5 h急速降至0.09。在此后的培养过程中，MN-ZLW-002菌株活菌数始终保持在108CFU/mL，溶氧值持续下降，自15 h达到最低值0.04并保持稳定。乳双歧杆菌Bb12的活菌数在发酵的前18 h均保持在107CFU/mL，第21 h开始增长至108CFU/mL。

表8 发酵过程中溶氧值及乳酸菌活菌检测结果

在乳双歧杆菌Bb12单独培养过程中，溶氧值于发酵5 h达到最低并保持0.10不变，整个过程中双歧杆菌活菌数均保持在107CFU/mL，但是在培养后期，活菌数略有下降。由此我们可以看出，脱脂乳中的氧气含量对嗜热链球菌MN-ZLW-002及乳双歧杆菌Bb12的生长都具有一定的影响。

进一步由图2、图3可知，当MN-ZLW-002菌株与双歧杆菌Bb12混合培养时，发酵4.5 h溶氧值即降至0.09，此后溶氧值继续下降，最低可达0.04。整个过程中嗜热链球菌MN-ZLW-002与乳双歧杆菌Bb12均持续增长。乳双歧杆菌Bb12单独培养时，溶氧值于发酵5 h达到最低值，并且至21 h始终保持在0.10，24 h为0.08，整个过程中Bb12活菌数基本保持不变。

图2 混合培养过程中溶氧值及乳酸菌计数变化曲线

图3 单独培养过程中溶氧值及乳酸菌计数变化曲线

嗜热链球菌MN-ZLW-002为兼性厌氧菌，而乳双歧杆菌Bb12为厌氧菌，虽然Bb12在非绝对厌氧条件下也可以生长，但显然绝对厌氧条件对其生长更为有利[18]。溶氧试验结果证实，嗜热链球菌MN-ZLW-002与乳双歧杆菌Bb12混合培养时，MN-ZLW-002菌株加速了培养基中氧气含量的降低，脱脂乳溶氧值降低速度较乳双歧杆菌Bb12单株培养更快，可使培养基较快的达到有利于乳双歧杆菌Bb12生长的厌氧条件，从而促进Bb12的生长。

2.4 MN-ZLW-002胞外多糖对Bb12生长的影响

嗜热链球菌MN-ZLW-002具有高产胞外多糖特性，经培养基组分及培养条件优化后，其在脱脂乳中发酵，胞外多糖的产量可达320 mg/L[19]。试验将活化好的Bb12菌株分别接入胞外多糖-MRS液体培养基及普通MRS液体培养基培养，通过观察不同培养基中乳双歧杆菌Bb12的生长情况，从MN-ZLW-002胞外多糖的角度研究嗜热链球菌MN-ZLW-002促Bb12生长的机理[20]，试验结果如表9所示。

表9 不同培养基中Bb12活菌计数对数值

图4 不同培养基中Bb12生长曲线

由以上图表可见，乳双歧杆菌Bb12在两种培养基中的生长规律为，0～4 h为生长适应期，从4 h开始进入对数生长期，至16 h以后生长趋于平稳。对不同培养基中Bb12的生长情况进行对比发现，胞外多糖-MRS培养基中，Bb12的活菌数在整个培养过程中始终高于普通MRS培养基，在24 h时高出0.5个数量级。因此，我们判断嗜热链球菌MN-ZLW-002还可以通过发酵代谢产生的胞外多糖菌株对乳双歧杆菌Bb12产生促生长作用。

3 结 论

试验以Bb12的活菌数变化为评价指标，分别在MRS液体培养基及发酵乳中对嗜热链球菌MN-ZLW-002促乳双歧杆菌Bb12生长作用进行了研究。结果表明，在MRS液体培养基中，MN-ZLW-002对Bb12的增殖产生了显著的促进作用（P＜0.05）。在发酵乳中，当MN-ZLW-002与Bb12按活菌数1∶1000复配参与发酵时，酸奶的发酵特征不受影响、组织状态和口感略有提升，且双歧杆菌活菌数显著提高（P＜0.05）。

试验从发酵过程中培养基溶氧值变化的角度初步探索MN-ZLW-002菌株对酸奶中乳双歧杆菌Bb12的促生长作用机理。结果表明，嗜热链球菌MN-ZLW-002与乳双歧杆菌Bb12混合培养时，MN-ZLW-002菌株加速了培养基中氧气含量的降低，使培养基较快的达到有利于Bb12生长的厌氧条件，从而促进Bb12的生长。另一方面，通过对比观察Bb12菌株在胞外多糖-MRS液体培养基及普通MRS液体培养基中的生长情况，从MN-ZLW-002胞外多糖的角度研究了嗜热链球菌MN-ZLW-002促Bb12生长的机理，试验结果表明，嗜热链球菌MN-ZLW-002还可以通过发酵代谢产生的胞外多糖对乳双歧杆菌Bb12产生促生长作用。