非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备与应用

郝丽影，王彦伟，孙玉洁，曹红梅，黄 甜，逄文强，李向东，邓均华，田克恭,

(1.洛阳普泰生物技术有限公司，河南 洛阳 471000；2.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、传染性疾病。自2018年8月3日我国确诊首例发生于辽宁省沈阳市沈北新区的疫情以来，ASF迅速在我国各省市蔓延[1-4]，给我国养猪业造成了巨大的损失，并严重威胁着世界养猪业的发展。

ASF尚无有效的疫苗，防控主要依靠严格的生物安全措施。敏感、准确的诊断试剂可为该病的防控提供可靠的工具。P30、P54、P72、PK205R蛋白均为目前ASFV诊断试剂研究的热点蛋白[5-10]。其中P30蛋白是ASFV的主要结构蛋白，且在病毒感染早期大量表达和分泌，是优良的早期检测靶标[11]。已有研究将P30蛋白应用于ASFV抗体的血清学检测，但将其单克隆抗体应用于胶体金检测试纸条的研究鲜有报道[12-15]。为此，利用原核系统表达重组P30蛋白并制备单克隆抗体，以期建立基于P30蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测法，旨在为ASFV的早期诊断提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因、质粒及感受态细胞 ASFVP30基因、pET28a质粒均由苏州金唯智生物科技有限公司合成、提供；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 供试细胞与病毒 SP2/0细胞由洛阳普泰生物技术有限公司保存；猪瘟病毒(SFV)C株、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1-R株、猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株、猪圆环病毒2型(PCV2)HH3株均由国家兽用药品工程技术研究中心提供。

1.1.3 供试动物 SPF级BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.4 主要试剂 ASFV阳性血清、ASFV抗原板、ASFV抗原等均购自欧洲非洲猪瘟参考实验室[Centro de Investigación en Sanidad Animal(CISA-INIA), Madrid, Spain]；Ni2+亲和层析填料购自美国GE Healthcare公司；HRP标记的羊抗猪IgG、羊抗鼠IgG均购自Thermo公司；HAT混合盐、HT混合盐、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等均购自Sigma公司；小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用ELISA试剂盒购自洛阳佰奥通试验材料中心。

1.2 方法

1.2.1 重组表达质粒pET28a-P30的构建 根据GenBank中ASFVP30基因序列(GenBank: MH766894.1)，进行大肠杆菌密码子优化，将优化后的基因送苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，5′和3′端分别引入酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ，并连接到pET28a质粒上。将合成的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落后提取质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒即为pET28a-P30。

1.2.2 重组P30蛋白的表达 将pET28a-P30质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落至LB培养基中培养过夜。取2 mL培养过夜的菌种接种至200 mL含卡那霉素的LB液体培养基，于37 ℃、220 r/min振荡培养。当菌液OD600值达到0.8～1.0时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG溶液于28 ℃诱导培养12 h。收集菌体，用高压匀质机破碎，取样通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

1.2.3 重组P30蛋白的纯化与Western blot鉴定 在菌体破碎上清液中加入0.01 mol/L咪唑后经0.45 μm过滤器过滤。取滤液采用Ni2+亲和层析法进行纯化。收集纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，通过光谱扫描分析目的蛋白的纯度，并利用Western blot鉴定其与ASFV阳性血清的反应性。

1.2.4 间接ELISA方法的建立 将P30蛋白稀释至0.1 μg/mL，混匀后加入酶标板，100 μL/孔，于2～8 ℃静置16～24 h；弃去板中液体，加入封闭液，200 μL/孔，于37 ℃封闭2 h；洗板，加入稀释后的样品，100 μL/孔，同时设置加PBS(0.01 mol/L，pH值7.4，下同)的孔为阴性对照，置37 ℃温育60 min；洗板，加入稀释至工作浓度的二抗，100 μL/孔，置37 ℃温育45 min；洗板，依次加显色剂A、B液，各50 μL/孔，振荡混匀后置37 ℃避光温育15 min，加入终止液，50 μL/孔，振荡混匀。设定酶标仪波长于450 nm处，测定各孔OD值。阴性对照OD值<0.2时试验成立，S/N(样品OD值/阴性对照OD值)≥2.1者，判为阳性；S/N(样品OD值/阴性对照OD值)<2.1者，判为阴性。

1.2.5 小鼠免疫 按照200 μL/只(含40 μg的重组P30蛋白)的量皮下多点免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫使用弗氏不完全佐剂。免疫间隔时间为7 d。于3次免疫后采集小鼠血清，用间接ELISA方法检测血清抗体效价。选择抗体效价高的小鼠进行细胞融合，于融合前3 d腹腔注射重组P30蛋白80 μg。

1.2.6 杂交瘤细胞株的建立

1.2.6.1 细胞融合 无菌分离免疫小鼠的脾细胞，将其与1.0×107～1.5×107个SP2/0细胞混合后，按照常规方法进行细胞融合。将融合后的细胞滴加至铺有饲养细胞的96孔细胞板，于37 ℃、5% CO2条件下静置培养。

1.2.6.2 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 当细胞长至孔底面积1/2～1/3时，取上清用1.2.4中所述间接ELISA方法检测。选择OD值高的孔采用有限稀释法进行亚克隆。反复进行杂交瘤细胞的筛选及亚克隆，直至单克隆孔的细胞上清检测阳性率为100%。

1.2.6.3 单克隆抗体的生产及效价测定 取BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5 mL/只。10 d后腹腔注射杂交瘤细胞，25万个细胞/只。待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，10 000 r/min离心10 min取上清，系列稀释后用1.2.4中所述间接ELISA方法检测，检测结果为阳性的孔对应的最高稀释度为腹水的抗体效价。

1.2.7 单克隆抗体的鉴定

1.2.7.1 亚类鉴定 用小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用ELISA试剂盒对单克隆抗体进行亚类鉴定，操作按说明书进行。

1.2.7.2 与ASFV的反应性鉴定 用ASFV抗原板按照常规间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)对单克隆抗体进行检测，以加PBS的孔作为阴性对照。

1.2.7.3 特异性鉴定 用猪瘟病毒C株、猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株、猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株、猪圆环病毒2型HH3株制备的抗原板，分别按照常规IFA方法对单克隆抗体进行检测，分别设置加病毒阳性血清、PBS的孔作为阳、阴性对照。

1.2.8 胶体金免疫层析检测法的建立 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，并标记纯化后的重组P30蛋白单克隆抗体制备胶体金标记垫。用另一纯化后的P30蛋白单克隆抗体包被检测线，用羊抗鼠IgG包被对照线，组装成胶体金检测试纸条。用试纸条检测梯度稀释的ASFV抗原以及阴性样品，优化配对抗体。选择检测灵敏度最高且背景清晰的抗体制备胶体金检测试纸条，再进一步对胶体金标记抗体制备的pH值、标记量、检测线包被的单克隆抗体浓度进行优化，获得最优工艺。

1.2.9 胶体金免疫层析检测法的初步评价 选择世界动物卫生组织(OIE)推荐的ASFV PCR方法检测阴性的猪脾、肺、肾、肝、淋巴结、扁桃体组织研磨液以及血清、抗凝全血共8份样品作为阴性样品，并在阴性样品中按照1∶50比例添加ASFV抗原，制备8份阳性样品。按照最优工艺建立的方法，对样品进行检测。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒pET28a-P30的构建

质粒双酶切后电泳检测，可见约600 bp的目的片段和约5 000 bp的pET28a载体片段(图1)，表明重组表达质粒pET28a-P30构建正确。

2.2 重组P30蛋白的表达

SDS-PAGE鉴定结果(图2)表明，菌种在IPTG诱导后可表达出重组P30蛋白，且表达的重组蛋白主要存在于上清中，大小约30 ku，与预期结果一致。

M:蛋白质Marker;1:未诱导全菌;2:诱导后菌体裂解液;3:诱导后菌体裂解液上清

2.3 重组P30蛋白的纯化与Western blot鉴定

采用Ni2+亲和层析法纯化上清中的可溶性重组P30蛋白。SDS-PAGE鉴定及光谱扫描结果表明,纯化后目的蛋白纯度约为83%(图3A)。Western blot结果显示，重组P30蛋白与ASFV阳性血清反应可见特异性的阳性反应条带(图3B)。表明重组P30蛋白具有良好的反应性。

M:蛋白质Marker;1:纯化的重组P30蛋白

2.4 P30蛋白免疫小鼠血清ELISA效价测定

利用P30蛋白免疫5只BALB/c小鼠，3免后小鼠血清的ELISA效价最高为1∶256 000。

2.5 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆

将杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法筛选，选择OD值高的阳性细胞进行亚克隆，经3～5次亚克隆获得10株稳定分泌P30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为4F7、2H4、1B11、1D4、5H3、4A7、4B10、2C8、3C11、2G1。

2.6 P30蛋白单克隆抗体的生产及效价测定

制备了10株分泌P30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的小鼠腹水，经间接ELISA方法检测，10株腹水的ELISA效价均高于1∶40 000。

2.7 P30蛋白单克隆抗体的鉴定

2.7.1 亚类鉴定 10株P30蛋白单克隆抗体的重链亚类为IgG1、IgG2b、IgG2a，轻链亚类均为Kappa(表1)。

表1 P30蛋白单克隆抗体亚类鉴定结果

2.7.2 与ASFV的反应性鉴定 IFA结果显示，10株P30蛋白单克隆抗体与ASFV反应后均可见明显的荧光，而阴性对照无可见荧光。表明10株P30蛋白单克隆抗体均可与ASFV反应(图4)。

A:单克隆抗体4F7与ASFV的反应;B:阴性对照

2.7.3 特异性鉴定 IFA结果显示，除阳性对照外，P30蛋白单克隆抗体与所有病毒反应后均无可见荧光(图5)，表明所有P30蛋白单克隆抗体与猪瘟病毒C株、猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株、猪伪狂犬病病毒Bartha-K61株、猪圆环病毒2型HH3株均不反应，特异性良好。

A:阳性对照;B:阴性对照;C:单克隆抗体4F7

2.8 ASFV胶体金免疫层析检测法的建立

经各项条件优化，确定胶体金免疫层析检测法的最优工艺为P30蛋白单克隆抗体1B11按照1.5 mg/mL的量包被，单克隆抗体4F7在pH值8.0、质量浓度为18 μg/mL条件下制备胶体金标记抗体。该工艺下制备的试纸条检测ASFV抗原的灵敏度最高，1∶100倍稀释检测仍为阳性。

用该方法检测8份阳性样品，检测结果均为阳性，8份阴性样品均为阴性，表明该方法可用于ASFV的检测。

3 结论与讨论

ASF的临床症状与猪瘟等猪常见病易混淆，其诊断需从流行病学、临床症状、病理变化、病原检测等方面综合分析，确诊主要依据实验室检测结果。随着国内ASF疫情的发展，临床检测对诊断方法的需求更加具体化。研制满足不同应用场景需求的多样化的诊断试剂，将为ASFV病毒疫情的监测及控制提供重要的支持。而单克隆抗体的制备，将为其免疫学诊断试剂的研发提供重要的生物原料。

P30蛋白由CP204L基因编码，为ASFV的内膜蛋白，是病毒重要的结构蛋白之一。有研究表明，在病毒感染2～4 h即有P30蛋白的表达，且可持续整个感染周期[16-17]。P30蛋白参与病毒内化，在病毒入侵宿主细胞的过程中起重要作用，具有良好的免疫原性，可引起机体产生高水平的抗体反应，于感染后8 d即可检测到抗体，是一种理想的血清学诊断和免疫学检测抗原[18-22]。

大肠杆菌表达系统遗传背景清晰、目的基因表达量高且表达周期短，是一种蛋白质表达的重要工具。前人利用大肠杆菌表达系统表达ASFV P30蛋白，经验证表达的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应性[18]。本研究利用大肠杆菌表达系统成功表达了可溶性的重组P30蛋白，用ASFV阳性血清进行Western blot鉴定，发现表达的重组蛋白有良好的反应原性。用纯化的重组P30蛋白免疫小鼠，间接ELISA方法检测小鼠血清效价最高为1∶256 000，表明该蛋白有良好的免疫原性。

PETROVAN等[11]的研究表明，P30蛋白单克隆抗体与ASFV有很好的反应性，利用IFA方法可以识别病毒，利用免疫组织化学方法可以检测感染猪组织中P30蛋白的表达，这些结果均表明，P30蛋白单克隆抗体可作为ASFV检测的重要工具。本研究制备的10株P30蛋白单克隆抗体，IFA检测显示均可与ASFV反应。利用2株P30蛋白单克隆抗体进行了ASFV胶体金免疫层析检测法的建立，初步评价可用于ASFV的抗原检测。以上结果表明，获得的P30蛋白单克隆抗体可为ASFV的免疫学诊断技术开发提供重要的生物原料，同时也可为ASFV P30蛋白的基础研究提供支持。