表达PCV2 Cap蛋白重组复制缺陷型腺病毒黏膜免疫效果

邓祖丽颖，刘雨丰，马宁宁，陈 陆

(1.郑州幼儿师范高等专科学校，河南 郑州450000；2.河南农业大学，河南 郑州450000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的病原。PCV2主要侵害2～8周龄断奶仔猪，死亡率高达50%，给养猪业带来巨大的经济损失。PCV2主要经口腔、呼吸道等黏膜侵入机体并侵害免疫系统，能直接或间接导致免疫抑制[1-2]。因此，PCV2疫苗设计应侧重于诱导机体产生有效的黏膜免疫[3]。圆环病毒增殖能力较低，常规灭活疫苗抗原含量不足，免疫反应缓慢而微弱，且易在动物体内引起过敏反应，且无法有效诱导病原体特异性黏膜免疫应答[4-5]。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞及细胞因子水平的变化趋势可以间接反映感染猪的免疫能力，尤其以IFN-γ参与的Th1型细胞免疫在抗病毒免疫防御中最为重要。腺病毒载体携带抗原种类多，抗原递呈能力强，且产生的免疫力持久、安全性高，适合作为病毒疫苗载体[6]。

Cap蛋白是PCV2的主要免疫原蛋白，含有主要保护性抗原表位,是制备PCV2疫苗的理想靶抗原。目前，各国学者已研究出有效的疫苗，如重组亚单位疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗等[7-9]，但许多研究成果仍处于实验室研究阶段。新型基因工程疫苗的价格普遍较高，且其基因改造是否会带来潜在危害还不清楚[10]。因此，研制高效廉价的新型疫苗尤为重要[11-12]，是增强免疫效果和降低经济损失的关键。研究表明，表达PCV2 Cap蛋白的重组腺病毒可诱导动物机体产生特异性抗体[13-16]。鉴于此，在前期构建PCV2 Cap蛋白主要抗原表位重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)的基础上，将其经滴鼻、口服和肌内3种免疫途径免疫小鼠，评价其所诱导的全身性和局部黏膜免疫应答效果，旨在为研发PCV2新型黏膜免疫疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

PCV2 Cap蛋白主要表位重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)和原核表达的PCV2 Cap蛋白由河南农业大学兽医传染病实验室构建、表达和保存；腺病毒载体(wild-rAd)由南京农业大学姜平教授惠赠；PCV2 YY株由河南农业大学兽医传染病实验室分离、保存；DNA提取试剂盒、SYBR Premix ExTaq酶等均购自TaKaRa公司；FITC-CD3、PE-CD4和PerCP-CD8a单克隆抗体等均购自Biolegend公司；HRP标记兔抗小鼠IgG购自博奥森公司；HRP标记羊抗小鼠IgA购自Bethyl公司；商品化细胞因子ELISA试剂盒购自CST公司。

供试Balb/c小鼠由河南农业大学兽医传染病实验室饲养。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank公布的PCV2Cap基因序列(登录号：KU960941.1)，应用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR ,qPCR)引物。上、下游引物序列分别为5′-TATCAATCTAACCACAGTC-3′和5′-ATGGCGGGAGGAGTAGTT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增目的基因长276 bp。

1.2.2 免疫和攻毒试验 将80只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分成4组，每组20只。rAd/Cap/518通过滴鼻(rAd/Cap/518 i.n)、肌内注射(rAd/Cap/518 i.m)和口服免疫(rAd/Cap/518 oral)，每只小鼠10lgTCID50，设空腺病毒(wild-rAd)滴鼻免疫(wild-rAd i.n)为对照。首免后14 d以相同剂量和方法加强免疫。加强免疫后14 d，每组取5只小鼠滴鼻攻毒3×105TCID50PCV2 YY株。

1.2.3 间接ELISA检测抗PCV2特异性IgG和 IgA抗体 采集首免后14、21、28、35、42 d小鼠血清样品及首免后14、21、28、35 d唾液、肺部灌洗液、肠道灌洗液。用间接ELISA分别检测PCV2特异性IgG和IgA抗体水平[17]。

1.2.4 T细胞亚群分析及细胞因子检测 分离首免后14、21、28 d小鼠脾脏淋巴细胞，用含10%犊牛血清的RPMI 1640稀释至1×107个/mL，加入96孔细胞培养板，100 μL/孔。每孔加入PCV2 Cap蛋白1 μg，5%CO2的37 ℃培养箱中培养48 h，收集细胞，PBS液洗2次，分别加入FITC-CD3、PE-CD4和PerCP-CD8a单克隆抗体，避光孵育30 min。洗细胞2次后,用FACS Calibur流式细胞仪分析CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞及CD3+CD8+T细胞亚群百分比。商品化细胞因子ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-4的分泌水平[18]。

1.2.5 qPCR检测病毒载量 PCV2 YY株攻毒后14 d，收集小鼠淋巴结、脾脏和肺组织。使用DNA提取试剂盒提取核酸，通过qPCR法检测PCV2病毒载量[19]。qPCR扩增体系(20 μL)：上、下游引物各0.8 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，样品DNA模板500 ng，ddH2O补足至20 μL。qPCR扩增条件：94 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，40个循环。

1.3 数据分析

利用GraphPad Prism对数据进行差异显著性分析，结果以数值平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 免疫小鼠血清IgG和唾液、肺部及肠道灌洗液IgA抗体

为检测全身体液免疫应答，采用间接ELISA方法测定免疫小鼠后14～42 d抗PCV2特异性IgG和 IgA抗体水平(图1)。免疫后21～42 d，rAd/Cap/518经肌内注射小鼠诱导产生的血清IgG抗体水平显著高于wild-rAd对照组及滴鼻和口服免疫组(图1A)。rAd/Cap/518经滴鼻免疫后21～28 d以及经口服免疫后35～42 d小鼠唾液诱导产生的特异性IgA抗体水平均显著高于对照组(图1B)。免疫后21～35 d，rAd/Cap/518经滴鼻免疫诱导肺部灌洗液中产生的特异性IgA抗体水平显著高于对照组(图1C)。免疫后21～35 d，rAd/Cap/518经口服途径免疫后诱导肠腔灌洗液中产生的特异性IgA抗体水平显著高于对照组(图1D)。

A:rAd/Cap/518经不同途径免疫小鼠血清中PCV2特异性IgG抗体动态变化；B—D:分别为rAd/Cap/518经不同途径免疫小鼠唾液、肺部灌洗液和肠道灌洗液中特异性IgA抗体动态变化。不同字母表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)，下同

2.2 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分析

由表1可知，在14、21、28 d，rAd/Cap/518经滴鼻、肌内和口服3种途径免疫诱导产生的CD3+T细胞百分率为46.60%～55.65%，显著高于对照组(P<0.05)。在21、28 d，rAd/Cap/518经滴鼻免疫诱导产生的 CD3+CD4+T细胞百分率为34.43%～37.29%；在14、21、28 d，rAd/Cap/518经肌内和口服途径诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为36.35%～41.58%，均显著高于对照组。在14、21、28 d，rAd/Cap/518经滴鼻途径诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为12.39%～18.32%；在28 d，rAd/Cap/518经口服免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为16.29%，均显著高于对照组。

表1 rAd/Cap/518经不同途径免疫小鼠脾脏淋巴细胞中T细胞亚群变化

2.3 免疫小鼠脾脏淋巴和肠系膜淋巴结细胞因子检测

从图2可以看出，与对照组相比，滴鼻免疫组小鼠脾脏淋巴和肠系膜淋巴结细胞中IFN-γ分泌量显著升高，分别达到299.5 pg/mL和635.5 pg/mL。各组均未检测到IL-4。

图2 不同途径免疫rAd/Cap/518小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞因子的分泌表达

2.4 qPCR检测免疫小鼠淋巴结、脾脏和肺组织PCV2病毒载量

从图3可以看出，与对照组相比，经滴鼻、口服和肌内3种途径免疫rAd/Cap/518后，小鼠脏器组织中PCV2病毒载量显著降低。

图3 小鼠脏器组织中PCV2 病毒载量

3 结论与讨论

PCV2通过黏膜侵入机体，是引起PMWS的主要病原，各国学者均致力于研究有效的疫苗来防控PMWS。本研究将rAd/Cap/518经滴鼻、口服和肌内3种免疫途径免疫小鼠，评价其所诱导的全身性和局部黏膜免疫应答效果。结果显示，rAd/Cap/518经不同途径免疫小鼠均可不同程度诱导血清PCV2特异性IgG抗体的产生，这与WANG等[15]的报道结果一致。黏膜疫苗能在黏膜部位有效诱导机体产生特异性IgA抗体[20]。rAd/Cap/518经滴鼻和口服免疫诱导产生较高水平的PCV2特异性IgA抗体，这与前人研究结果一致[21-22]。rAd/Cap/518经滴鼻和口服途径免疫能在唾液、肺部和肠道灌洗液中产生较高水平IgA抗体，肌内途径免疫后期肠道灌洗液中检出微弱的IgA抗体，与CRAIG等[23]的研究结果一致。本研究结果表明，腺病毒载体疫苗经黏膜途径免疫后可诱导局部黏膜部位产生IgA抗体以及血清IgG抗体。

细胞免疫应答在控制免疫缺陷性疾病中起重要作用[24]。本研究结果显示，与对照组相比，rAd/Cap/518诱导小鼠脾脏CD3+T细胞含量显著增加，肌内和口服途径免疫组CD3+CD4+T细胞显著增加，滴鼻免疫组CD3+CD8+T细胞显著增加。可见，rAd/Cap/518可以诱导细胞免疫反应，且滴鼻免疫可能会起到更好的免疫保护作用。通过检测细胞因子分泌水平进一步研究rAd/Cap/518所诱导的细胞免疫反应类型，结果显示，滴鼻免疫组检测到高水平的IFN-γ，但各组均未检出IL-4。表明诱导的细胞免疫反应以Th1型为主。攻毒后体内病毒载量检测结果显示，rAd/Cap/518经3种途径免疫组病毒载量均显著降低，表明rAd/Cap/518免疫后能有效阻止病毒感染。

综上，本研究将rAd/Cap/518经口服、滴鼻和肌内3种途径免疫小鼠，发现经滴鼻和口服途径免疫能诱导全身性和局部黏膜免疫应答，并且能显著清除PCV2感染，因此其具有很大应用前景。虽然小鼠可作为PCV2感染研究的理想动物模型[25]，但rAd/Cap/518在猪体内的应用效果还有待进一步研究。