基于SSR分子标记的红安县省沽油遗传多样性分析

李 静，田思雨，毛威涛，姚国新,2

(1.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000；2.粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北 武汉 430000)

省沽油(StaphyleabumaldaDC)是省沽油科(Staphyleaceae)省沽油属(Staphylea)植物，优质的药食两用木本，属珍稀经济植物，是我国罕见的食用灌木[1-2]，也可作观赏苗木，利用价值极高。其顶生白花似珍珠，也被称为珍珠花，花蕾和幼叶口味清香且富含大量人体所必需的营养元素，有助于增强人体免疫力而受到人们的广泛喜爱[3]；其果实可治疗干咳，根可治瘀，长期食用省沽油能明显降低血压、血脂[4]。目前，对省沽油的研究主要集中在繁育技术[5-7]、营养成分[8]、药用价值[9]和油分含量[10-11]等方面，分子生物学方面的研究报道较少[12-14]。由于省沽油资源量小，以采摘花蕾为主，很少留花结果，且种子发芽率低，导致其分布零散[15]，加之缺乏管理和保护，导致相当部分省沽油野生资源被破坏。红安县地处湖北省孝感市，省沽油分布范围较广，多为零星小片分布，偶有成片种植，当地居民有食用省沽油的习惯，随着近年来的开发建设，省沽油野生资源破坏严重，急需进行资源保护和遗传多样性研究。为此，采集红安县内24份省沽油野生材料，利用SSR(Simple sequence repeats)标记研究红安县省沽油的遗传多样性，以期为省沽油植物种质资源保护利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2019年4月，在湖北省红安县24个地点(表1)采集省沽油的幼嫩叶片，装入自封袋中，放入冰盒带回实验室，-20 ℃低温冰箱保存，用于DNA提取。

表1 红安县省沽油采样地点

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取试剂配制 参考赵静等[16]改良的CTAB(Cetyl-trimethyl-ammonium bromide)法配置DNA提取试剂，每100 mL CTAB溶液中包含2.5 mol/L NaCl 56 mL、PVP(Polyvinyl pyrrolidone)1 g、0.5 mol/L EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)4 mL、1 mol/L Tris(Tris metyl aminomethane)-HCl 10 mL、CTAB 2 g。

1.2.2 DNA提取 采用改良CTAB法提取红安省沽油幼嫩叶片的DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，稀释至20 ng/μL后-20 ℃低温冰箱保存备用。

1.2.3 SSR引物 利用前期检测到的有多态性的21对引物(结果未发表，详见表2)进行省沽油遗传多样性分析。

表2 SSR标记信息

1.2.4 PCR(Polymerase chain reaction)扩增及电泳 PCR反应体系：PCR-Mix 5 μL，上、下游引物各1 μL(10 ng/μL)，DNA模板1 μL，加水补充至10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳[17]，并进行银染[18]。

1.2.5 遗传多样性分析 统计聚丙烯酰胺凝胶电泳图条带，依据SSR标记统计的数据(按照分子质量从大到小的顺序，将不同等位纯合变异位点编号为AA、BB、CC、DD、…；杂合位点按等位变异组成大小编号为AB、BC、AC、AD、BD、CD、…)形成矩阵，利用PopGene 32软件计算不同地点省沽油的观测等位变异数(Observed number of alleles,Na)、有效等位变异数(Effective number of alleles,Ne)、Shannon-Weaver多样性指数(Shannon’s information index,I)、观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity,He)、Nei’s遗传多样性指数(Nei’s genetic diversity index,H)等。根据NEI[19]的方法计算标记位点的多态性信息含量(Polymorphism information content，PIC)。

1.2.6 聚类分析 统计电泳图条带，有、无分别记为1、0，形成矩阵，利用NTSYSpc 2.10软件计算24个省沽油的遗传相似系数(Genetic similarity coefficient ,GS)，采用UPGMA进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 红安县省沽油SSR标记多态性位点分析

本研究利用21对引物对红安县不同地点24个省沽油样本进行检测，图1为引物S086扩增产物电泳图。共检测到56个等位变异(表3)，每对引物等位变异数为2～5个，平均每对引物可检测到2.95个等位变异，引物S100扩增等位变异最多，达到5个，其次是S052、S060、S086、S095，均为4个。21对引物的Ne为0.635 4～2.748 2个，平均为1.622 3个。各引物的PIC值为0.115 4～0.752 3，平均为0.438 9，12对引物检测到的PIC超过平均值，占所有引物的57.14%。

图1 红安县省沽油S086引物扩增产物检测结果

表3 红安县省沽油的多样性指数分析

2.2 红安县省沽油的遗传多样性分析

红安县省沽油的I为0.296 3～1.731 9，平均为0.772 9，最小的是引物S094，最大的为引物S086；Ho为0.102 7(S095)～0.412 3(S021)，平均值为0.241 5；He为0.129 7(S090)～0.413 9(S001)，平均值为0.250 2；H为0.157 4(S071)～0.762 5(S086)(表3)。所筛选出的21对SSR引物能较好地反映红安县不同地点间省沽油的遗传多样性信息。

2.3 红安县省沽油的聚类分析

进行聚类分析发现(图2)，红安县省沽油的GS值为0.58～0.93，平均值为0.78。其中，C04和C16、C05和C06的GS值最大(0.93)，距离最近；C05与C20的GS最小(0.58)，距离最远。将红安县省沽油分为两大类，C20(上观音墩)、C17(张家岗)和C23(段家凹)3个地点的省沽油聚为第Ⅰ类，其余地点省沽油聚为第Ⅱ类。第Ⅱ类可再分为两类，C09(石林寺)、C22(塘塆)、C24(上屋冲)、C11(沙岭咀)、C19(李家湾)、C21(彭唐)、C12(仰天窝)、C14(新屋冲)聚为Ⅱ-1类,C01(李家凹)、C02(中程岗)、C10(上孙家)、C18(西河口)、C03(黄狮冲)、C04(和平场)、C08(暗冲)、C16(高山岗)、C13(汪家)、C15(董家盆水库)、C05(况家寨)、C06(黑冲)、C07(窑包山)聚为Ⅱ-2类。

图2 红安县省沽油的聚类分析

3 结论与讨论

本研究利用21对SSR引物对红安县不同地点的24个省沽油样本进行遗传多样性研究，平均每对引物扩增出2.95个等位变异，Ne平均为1.622 3个，I平均值为0.772 9，H平均值为0.361 8。与陈龙灿等[12](Ne=1.271，H=0.165，I=0.257))、李凤鸣等[13](Ne=1.325 3，H=0.196 4，I=0.302 3)、叶欢等[14](Ne=1.431 9，H=0.265 3，I=0.411 8)研究结果相比，湖北省红安县野生省沽油的遗传多样性水平较高。省沽油主要为虫媒植物，各地种群之间相隔一定距离，不能进行广泛的基因交流，遗传多样性的保护应以种群间为主，种群内为辅。

本研究将红安县的24个省沽油分样本为两大类，C20(上观音墩)、C17(张家岗)和C23(段家凹)3个地点的省沽油聚为第Ⅰ类，其余地点省沽油聚为第Ⅱ类。不同种源的省沽油种子的脂肪酸含量等性状有较大的差异[20]，通过聚类分析可筛选出优良种质进行人工驯化栽培，推进红安县的林业经济发展。