高效液相色谱法测定喉蛾散中盐酸小檗碱含量
2020-10-16陈武军
陈武军
(福建省漳州市中医院,福建 漳州 363000)
喉蛾散是由黄连、黄柏、桔梗、蜜甘草、琥珀、薄荷、硼砂、煅硼砂、珍珠、冰片、甘草、青黛、山豆根等中药组方,具有清热解毒、消肿止痛的功效,适用于咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿疼等痰热证。黄连、黄柏均有清热燥湿、泻火解毒功效,其主要活性成分为盐酸小檗碱等多种生物碱,具有抗病毒、抗菌消炎、降血压、降血糖、降低血清胆固醇、抗癌、抗心律失常、升白细胞、清热解毒、利胆等生理活性[1]。为更有效控制喉蛾散的质量,确保患者用药安全有效可控,本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法对喉蛾散中黄连、黄柏所含活性成分盐酸小檗碱进行含量测定。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters e2695型高效液相色谱仪,包括紫外检测器,Empower色谱工作站(美国Waters公司);TU-1900型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);ME104E型电子天平(精度为万分之一),XP26型电子天平(精度为百万分之一),均购自梅特勒-托利多仪器<上海>有限公司;KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,功率为250 W,频率为40 kHz)。
1.2 试药
盐酸小檗碱对照品(批号为110713-201212,纯度为86.7%,中国食品药品检定研究院);喉蛾散(医院制剂,批号分别为 20190601,20190602,20190701);乙腈为色谱纯(美国Merk公司,批号为JB085530);磷酸为色谱纯(美国Fisher公司,批号为190900);甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司,批号为20190910);水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Waters Xridge RShield RP18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm),以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:乙腈(A)-0.05% 磷酸溶液(B),梯度洗脱,详见表 1;柱温:30 ℃;检测波长:265 nm;流速:1 mL /min;进样量:5 μL。在此色谱条件下,理论板数按盐酸小檗碱峰计大于11 000。
表1 流动相梯度洗脱程序表
2.2 溶液制备[2-3]
对照品溶液:取盐酸小檗碱7.18 mg,精密称定,加70%乙醇溶解并定容至50 mL,制成每1 mL含盐酸小檗碱143.60 μg的对照品母液。
供试品溶液:取样品(批号为 20190602)0.2 g,精密称定,精密加入70%乙醇25 mL,称定质量,超声处理(功率为 250 W,频率为 40 kHz)30 min,取出,放凉,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
阴性对照品溶液:按喉蛾散处方和工艺制备缺黄连、黄柏阴性样品,按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。
2.3 方法学考察[4]
专属性试验:取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各5 μL,按拟订色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中,在与盐酸小檗碱对照品相应保留时间处有吸收峰,而缺黄连、黄柏的阴性对照品溶液在对应保留时间处无吸收峰出现,阴性对照无干扰。色谱图见图1。
线性关系考察:分别精密吸取对照品母液1,3,5,7 mL,置 20,10,10,10 mL 容量瓶中,并分别用 70%乙醇溶剂并定容,摇匀,连同母液得系列对照品溶液,分别精密吸取5 μL,按拟订色谱条件进样测定,以对照品质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程Y=20 575X-2 715.7,R2=0.999 9(n=5)。结果表明,盐酸小檗碱质量浓度在 7.18 ~143.60 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。
图1 高效液相色谱图
精密度试验:精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液(71.80 μg /mL)5 μL,按拟订色谱条件进样测定,连续进样6次,计算其峰面积的相对标准偏差。结果的RSD为2.14%(n=6),表明仪器精密度良好。
重复性试验:取同一批(批号为20190602)样品6份,依法制备供试品溶液,分别精密吸取5 μL,按拟订色谱条件进样测定。结果盐酸小檗碱的平均含量为0.88%,RSD为 1.87%(n=6),表明方法重复性良好。
稳定性试验:取同一供试品溶液适量,分别于0,2,4,8,12,24h时按拟订色谱条件进样测定。结果的RSD为2.61%(n=6),表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
加样回收试验:取已知含量的样品(批号为20190602,盐酸小檗碱的含量为0.874%)6份,每份0.2 g,精密称定,分别精密加入适量盐酸小檗碱对照品,依法制备供试品溶液,分别精密吸取5 μL,按拟订色谱条件进样测定,并计算回收率。结果见表2。
表2 盐酸小檗碱加样回收试验结果(n=6)
2.4 样品含量测定
取3批样品(批号分别为20190601,20190602,20190701),依法制备供试品溶液,按拟订色谱条件进样测定,用外标法计算喉蛾散中盐酸小檗碱的含量。结果见表3。
表3 3批样品中盐酸小檗碱含量测定结果(n=3)
3 讨论
3.1 检测波长选择[5-6]
为尽可能多地采集到丰富的物质成分信息,参考2015年版《中国药典(一部)》中黄连的盐酸小檗碱、黄柏的盐酸小檗碱,甘草的甘草苷、甘草酸,苦参的苦参碱、氧化苦参碱等指标成分的检测波长,曾分别于230,265,340nm波长处进行预试验,结果甘草苷、甘草酸峰高较低,分离度差,基线噪音影响大,定量不准确。盐酸小檗碱峰高相对较高,样品干扰少,分离度好,且基线平稳,适合作为含量测定指标成分,故选择盐酸小檗碱最大吸收波长265 nm作为喉蛾散中盐酸小檗碱含量测定的紫外检测波长。
3.2 流动相选择[7-10]
曾选择乙腈-1.5%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇-水等流动相系统进行预试验,结果显示,采用乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相梯度洗脱,供试品溶液中盐酸小檗碱与其他峰分离较好,故选其作为流动相。
3.3 提取溶剂选择[11-12]
在原供试品溶液制备方法基础上考察了不同提取溶剂(70%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水)对含量测定指标成分的影响,以水为溶剂进行提取时,盐酸小檗碱的含量明显降低,70%甲醇和70%乙醇的差异不大,因甲醇具有中枢神经系统毒性,故选用乙醇体系的溶剂。分别对不同比例的乙醇提取溶剂进行比较,发现70%乙醇为提取溶剂时得到的盐酸小檗碱的含量最高,故最终选择70%乙醇为提取溶剂。