白藜芦醇苷在增强ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞增殖能力及抑制炎性因子表达中的作用*

石春林 ，沙前坤 ，陈 瑾 ，刘 俊

（1.重庆市永川区人民医院，重庆 402100； 2.重庆央都生物研究院药学部，重庆 408000； 3.重庆医科大学附属第一医院皮肤科，重庆 400016； 4.重庆市沙坪坝陈家桥医院，重庆 401331）

在动脉粥样硬化斑块的形成过程中，其诱发因素较多，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的炎性损伤是其中最重要的因素，其作用机制表现为：ox-LDL作用→巨噬细胞进入血管内皮→形成泡沫细胞→粥样硬化斑块形成［1］。ox-LDL与血管炎性反应密切相关，单核细胞趋化因子 1（MCP-1）、白细胞介素 6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等均为常见炎性因子，其表达会直接影响细胞膜脂质过氧化而损伤血管内膜，进而参与到动脉粥样硬化斑块的形成中［2-3］。虎黄烧伤搽剂为中医常见制剂，具有泻火解毒、凉血活血、消肿止痛、燥湿敛疮等功效，含有多酚类植物抗毒素白藜芦醇苷。白藜芦醇苷是组蛋白去乙酰化酶沉默信息调控因子（SIRT1）家族的主要激动剂，有保护心肌、延缓衰老及抗炎抗氧化作用［4-5］。刘雅倩等［6］的研究指出，白藜芦醇苷能增强THP-1巨噬细胞的增殖能力，抑制炎性因子的表达，但其作用机制尚不明确。动物实验表明，白藜芦醇苷能通过调控SIRT1蛋白对ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞的增殖能力起到有效作用［7］，也能抑制炎性因子的产生，但由于国内相关文献报道不多见，具可靠性和真实性有待进一步证实。本研究中探讨了白藜芦醇苷对巨噬细胞增殖、炎性细胞因子的干预作用及作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：TP-1200C型电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司，精度为 0.01 g）；1658001 型电泳仪（美国Bio-Rad有限公司）；PY-16型恒温培养箱（南京畅翔仪器设备有限公司）；WD-9405F型脱色摇床（北京六一生物科技有限公司）；1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SAT-680T型酶标仪（上海巴玖实业有限公司）。

试药：THP-1人单核细胞株（中科院上海细胞生物所细胞中心）；虎黄烧伤搽剂（重庆喜旋生物科技有限公司，国药准字Z20010151，规格为每瓶50 mL）；白藜芦醇苷（中国药品生物制品检定所，纯度大于98%，规格为每瓶 20 mg）；RPMI-1640培养基（美国 Gibco公司）；TNF-α及IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（深圳晶美生物有限公司）；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒，生物素标记的山羊抗兔二抗或生物素标记的山羊抗小鼠二抗，HRP标记的链霉亲和素（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 THP 巨噬细胞制备

细胞复苏后均匀平铺于培养基中，加入含100 mL／L胎牛血清的培养液，置含50 mL／L CO2的37℃电热恒温箱孵育，细胞汇合至0左右，以2×104个／mL细胞数接种于 96 孔板，每孔 100 μL，包含 160 nmol／L PMA 培养液，置含50 mL／L CO2培养箱中诱导贴壁36 h，弃培养液，每孔再加入培养液100 μL。在白藜芦醇苷处理前添加 0，30，90 μmol／L ox-LDL 对巨噬细胞预处理 4 h，用 5，25，50 μmol／L 白藜芦醇苷分别处理巨噬细胞 4，8，16 h。将所有THP-1巨噬细胞分为3组。对照组仅加入普通培养基，ox-LDL组加入ox-LDL，白藜芦醇苷组加入白藜芦醇苷。以白藜芦醇苷作为标准品，采用高效液相色谱（HPLC）法对虎黄烧伤搽剂中的白藜芦醇苷进行含量测定［8-9］。

1.2.2 细胞增殖活性检测

将各处理组终点细胞，在 96孔板加入100 μL CCK-8工作液，置37℃恒温箱孵育过夜。次日，避光采用酶标仪于450 nm波长处检测各细胞标本的吸光度（A）值。

1.2.3 炎性因子水平测定

收集处理后的细胞，用蛋白提取试剂盒分别提取细胞总蛋白及核蛋白，用BCA法进行蛋白质定量。取蛋白质40 μg，10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，蛋白质电转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，牛血清白蛋白（BSA）室温封闭 2 h，加入一抗，分别加入小鼠抗MCP-1抗体（1∶500）、小鼠抗IL-6抗体（1∶1 000）、小鼠抗 TNF-α 抗体（1 ∶800），室温孵育12 h，TBST缓冲液洗膜30 min；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h；TBST洗膜30 min，采用蛋白质印迹（WB）荧光检测试剂激发荧光，显示于X光片，显影，定影，进行图像分析。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 23.0统计学软件分析。计量资料以X±s表示，行t检验；计数资料以百分比（%）表示，行χ2检验。呈非正态分布数据，多组间比较采用One-way ANOVA检验，组间两两比较行SNK法。相关性分析采用Pearson法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞增殖能力中的作用

采用 0，30，90 μmol／L ox-LDL 对 THP-1 巨噬细胞预处理 4 h 后，采用 5，25，50 μmol／L 白藜芦醇苷分别处理巨噬细胞，于4，8，16 h时分别检测细胞增殖活性。结果显示，THP-1巨噬细胞增殖活性与ox-LDL处理浓度和时间有一定相关性，除去90 μmol／L ox-LDL处理16 h THP-1巨噬细胞的增殖活性低于8 h外，其余均表现为浓度越高，时间越长，增殖活性越强。详见表1。

表1 ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞增殖活性的时间和浓度依赖性（X±s）

选择 90 μmol／L ox-LDL，进一步分析白藜芦醇苷在增强ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞增殖能力中的作用。在 ox-LDL 处理后，添加 5，25，50 μmol／L 3 种浓度的白藜芦醇苷处理4 h后，THP-1巨噬细胞增殖活性分别为 （1.25±0.34）A，（1.36±0.41）A，（1.49±0.51）A。结果显示，与ox-LDL处理组相比，白藜芦醇苷的浓度达到50 μmol／L时，其对THP-1巨噬细胞增殖活性的影响最显著。

2.2 白藜芦醇苷在增强ox-LDL抑制炎性因子表达中的作用

ox-LDL组的MCP-1，IL-6，TNF-α炎性因子水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。白藜芦醇苷组MCP-1，IL-6，TNF-α炎性因子水平高于对照组，但低于 ox-LDL 组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示白藜芦醇苷能抑制炎性因子的表达，其中可能与增强ox-LDL诱导有关。详见表2和图1。

表2 3组相关炎性因子水平比较（±s，ng ／L）

表2 3组相关炎性因子水平比较（±s，ng ／L）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与 ox-LDL 组，△P ＜0.05。

组别对照组ox-LDL组白藜芦醇苷组MCP-1 12.54 ± 3.67 27.41 ± 8.12*16.58 ± 4.91△IL-6 65.45 ± 13.47 102.62 ± 23.08*84.15 ± 20.64△TNF-α 1.65 ± 0.54 2.89 ± 0.76*2.03 ± 0.61△

图1 巨噬细胞MCP-1，IL-6，TNF-α蛋白水平

3 讨论

巨噬细胞介导冠状动脉粥样硬化的进展是冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）的主要病理机制。脂质蛋白被氧化修饰作用后，会入侵受损的内皮细胞，在趋化因子的作用下导致单核细胞发生迁移至内膜下，单核细胞膜体与ox-LDL相结合，分化成巨噬细胞，并分泌多种促炎因子，较常见的有 IL-6，IL-8，TNF-α等，使平滑肌层细胞迁移、内皮细胞增生，增加粥样斑块的不稳定性［10-11］。可见，单核巨噬细胞的功能状态直接影响斑块的稳定性。因此，干预冠状动脉粥样硬化必须对巨噬细胞进行干预，以此提升治疗效果，达到治疗目的。

在巨噬细胞的分化过程中，ox-LDL具有至关重要的作用［12］。借助巨噬细胞与内皮整合素家族受体结合，ox-LDL能诱导局部促进炎性反应损伤血管内膜，产生一系列细胞分化增殖异常反应［13］。MA 等［14］研究认为，ox-LDL是促使巨噬细胞参与形成不稳定斑块的重要因素，诱导斑块周边细胞增殖与过度凋亡，增加了脂质池内部的容积，减少了纤维帽钙化的硬度。本研究结果显示，THP-1巨噬细胞增殖效应与ox-LDL呈一定的时间和浓度依赖性。其中，30 μmol／L干预16 h时增殖效果最显著。进一步分析炎性因子水平的变化情况发现，IL-6，TNF-α等水平在ox-LDL作用后均有不同程度的升高，证实了ox-LDL诱导巨噬细胞增殖与炎性因子的介导有关。MCP-1是核因子 κB（NF-κB）的调控关键糖蛋白，是炎症介导通路中的关键靶点，能直接诱导单核巨噬细胞趋化迁移，对IL-6，TNF-α炎性细胞因子的表达具有激活作用［15］。SHAYGANNI等［16］研究发现，动脉粥样硬化斑块的形成过程中，会被过度修饰的脂质蛋白直接激活炎症通路，使MCP-1的表达得到增加，发生平滑细胞的过度增殖。本研究结果显示，在ox-LDL作用下，除IL-6和TNF-α上升外，MCP-1也明显增加，表明ox-LDL诱导巨噬细胞的增殖，与MCP-1的表达密切相关。白藜芦醇苷是一种多酚类中药提取物，是SIRT1的有效激活剂，可改善细胞代谢，对自噬水平的调控也有一定作用。研究表明，白藜芦醇苷能有效抑制NF-κB的活性水平，促进谷胱甘肽过氧化物酶的表达［17］。本研究结果显示，白藜芦醇苷作用后，巨噬细胞明显增殖，同时MCP-1，IL-6，TNF-α炎性细胞因子水平明显下降，进一步证实了白藜芦醇苷在ox-LDL诱导巨噬细胞增殖中的作用，抗炎性细胞因子表达的效应被抑制。

综上所述，虎黄烧伤搽剂中白藜芦醇苷能增强THP-1巨噬细胞的增殖能力，抑制炎性因子的表达，可能与减少ox-LDL诱导有关。