乳癖平颗粒质量标准研究

2020-10-16胡斌，胡婧，邓莉，马攀

中国药业 2020年19期

胡斌，胡婧，邓莉，马攀

（中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院药剂科，重庆 400038）

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ZF-1型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；BT124S 型电子天平（精度为 0.1 mg），BP 211D 型电子天平（精度为0.01 mg），均由赛多利斯科学仪器有限公司生产；KQ-4000KDE型高功率数控清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为400 W，频率为40 kHz）；硅胶G薄层板（青岛海浪硅胶干燥剂厂）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

1.2 试药

表儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为 110878-200102，纯度为 100.0%）；枸橼酸对照品（批号为 100396-200302，纯度为 100.0% ），芒柄花素对照品（批号为 111703-200603，纯度为 100.0% ），均购自中国食品药品检定研究院；山楂对照药材（批号为121138-200905），鸡血藤对照药材（批号为121173-200903），均购自中国药品生物制品检定所；乳癖平颗粒（批号分别为 180805，180815，180820，180826，180828，180910，180912，180916，180920，180928，我院院内制剂）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国 Tedia公司）；超纯水、其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

山楂：取样品10g，加甲醇20mL，超声处理15min，滤过，取滤液作为供试品溶液。取处方中除山楂药材以外的其余药材，制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。另取山楂对照药材0.1 g，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。再取枸橼酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.125 mg的对照品溶液。取上述4种溶液各8 μL，分别点于同一块聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯 -甲醇 -甲酸（10∶4∶1，V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.1%溴甲酚绿乙醇溶液，日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液、对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

图1 薄层色谱图

鸡血藤：取样品10 g，加乙醚 100 mL，超声处理30 min，分取乙醚层，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取处方中除鸡血藤药材以外的其余药材，制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。另取鸡血藤对照药材4 g，加水煎煮2次，浓缩至10 mL，加乙醚20 mL，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。再取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的对照品溶液。取上述4种溶液各20 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿 -乙酸乙酯（20∶3∶12，V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯下（254 nm）检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液、对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（11 ∶89，V／V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 溶液制备

取表儿茶素对照品（批号为 110878-200102）10.27 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释、溶解、定容并摇匀，制成质量浓度为0.4108 mg／mL的表儿茶素对照品贮备液；取贮备液1 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释成每1 mL含16.43 μg的对照品溶液。取乳癖平颗粒，研细，取2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（60 kHz）处理 30 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例取缺山楂、鸡血藤的各药材，加水煎煮，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

作为小学教师，应当走出传统教学模式的束缚，做到以人为本，重视学生的主体地位，真正结合学生的认知能力、心理特点和年龄特性，合理开发和利用教育资源，通过信息化、多媒体的教学手段，来让学生真正参与其中，发挥他们的主观能动性，通过多样化、个性化的信息学习体验，来帮助学生更深入地学习理论知识。

图2 反相高效液相色谱图

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别取 2.2.2项下 3种溶液各 20 μL，进样测定，记录色谱图。结果见图2。

线性关系考察：取表儿茶素对照品10.27 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇稀释、溶解并定容至刻度，得质量浓度为 410.8 μg／mL 的溶液。分别取 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，稀释至 10 mL，制成质量浓度为8.216，16.432，24.648，32.864，41.080 μg ／mL 的对照品溶液，进样20 μL，记录色谱图，以进样质量浓度为横坐标（C）、峰面积为纵坐标（A）绘制标准曲线，得回归方程A＝14.25C＋2.58，r＝0.999 9（n＝5）。结果表明，表儿茶素质量浓度在 8.216 ～41.08 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液20 μL，按拟订色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果的RSD为0.76%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为180910）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，于常温下放置 0，2，4，6，12，24 h后进样，测定峰面积。结果的RSD为1.88%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取乳癖平颗粒（批号为180910）共6份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果测得表儿茶素含量平均值为0.271 8 mg／g，RSD为1.89%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取 6 份已知含量（0.271 8 mg ／g）的乳癖平颗粒（批号为 180910）1.0 g，精密称定，另取表儿茶素对照品12.10 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得对照品溶液（每1 mL含表儿茶素0.242 0 mg）。精密量取对照品溶液1 mL，置各样品中，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表1。

表1 表儿茶素加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

分别取10批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量。结果批号分别为 180805，180815，180820，180826，180828，180910，180912，180916，180920，180928 的样品中每 10 g 表儿茶素的含量平均值约为1.40 mg。考虑到中药材原料含量季节性强、波动大，以平均值下浮20%制订本制剂的含量限度，故暂定每袋颗粒（10 g）中表儿茶素不得低于1.12 mg。

3 讨论

3.1 薄层色谱条件选择

在进行TLC鉴别时，考虑可能保留的成分为水溶性成分，根据文献［4-6］与预试验结果综合分析，确定鉴别成分为山楂中的枸橼酸和鸡血藤中的芒柄花素。在山楂的TLC鉴别中，曾尝试了以展开剂三氯甲烷-甲醇 -甲酸（10 ∶1 ∶0.1，V／V／V）［7］为基础，调整比例，在硅胶G板上展开，分离效果不好，干扰大，把硅胶G板变为聚酰胺薄膜后，发现聚酰胺薄膜对枸橼酸这种极性化合物有特异的分辨能力，分离效果明显改变。优化展开剂，用极性更大更环保的乙酸乙酯代替三氯甲烷，调节各组分比例，展开剂变为乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶4∶1，V／V／V）后，薄层色谱效果明显变好，显色后黄色斑点清晰，无干扰，分离度好。在鸡血藤的TLC鉴别中，尝试了多种展开剂［8-11］，杂质多，干扰大，改用乙醚代替乙酸乙酯提取后，杂质明显减少，调整展开剂后，分离度好，无干扰，定为最优条件。

3.2 HPLC条件选择

曾对聚酰胺柱色谱法［12］与超声提取法进行了比较，发现聚酰胺柱色谱法能很好地去除供试品中的杂质，但耗时长，损失大；超声提取法方便、快捷，但杂质含量较高，考虑到实际生产检验需要，选取了快捷、高效、方便的超声提取法，通过改变HPLC条件［12-15］，达到测定目的。

3.3 指标成分选择

曾以枸橼酸［7，16-17］、芒柄花素［9］、熊果酸［18］及金丝桃苷［19-20］为主要指标成分，采用HPLC法对其进行测定。枸橼酸对照品9 min后出峰，样品成分复杂且含量在此处干扰峰多，曾试过多种提纯方法，效果不明显；芒柄花素、金丝桃苷及熊果苷均是对照品出峰正常，供试品中均无相应峰出现。考虑枸橼酸、芒柄花素都是TLC鉴别的成分，含量、稳定性都应优于其他成分，应成为后期研究的重点。

3.4 提取方法及提取条件选择

提取方法考察：取乳癖平颗粒（批号为180910）2.0g，精密称定，分别采用超声（60 kHz）处理30 min和加热回流30 min的方法处理，按拟订色谱条件进样测定。结果加热回流和超声提取表儿茶素含量分别为0.23，0.24 mg／g。可见，2 种方法的提取率无明显差异，因超声处理较简便，故采用超声方法进行提取。

提取溶剂考察：取乳癖平颗粒（批号为180910）2.0g，精密称定，分别用100%甲醇，80%甲醇，50%甲醇，30%甲醇各 25 mL，超声（60 kHz）提取 30 min，按拟订色谱条件进样测定。结果表儿茶素含量分别为0.08，0.15，0.23，0.19 mg ／g。可见，采用 50% 甲醇提取时表儿茶素提取率较高，且杂质较少，故选用50%甲醇作为提取溶剂。

提取溶剂量考察：取乳癖平颗粒（批号为180910）2.0 g，精密称定，分别加入 50% 甲醇 10，20，25，30，40，50 mL，超声（60 kHz）提取 30 min，按拟订色谱条件进样测定，计算含量。结果表儿茶素含量分别为0.20，0.22，0.23，0.23，0.23，0.24 mg ／g。可见，加入 50% 甲醇量为25 mL时，能基本将表儿茶素提取完全，故选用25 mL 50%甲醇为提取溶剂量。

提取时间考察：取乳癖平颗粒（批号为180910）2.0g，精密称定，加入50%甲醇25 mL，分别超声（60 kHz）提取 10，20，30，40，50，60 min，按拟订色谱条件进样测定。结果表儿茶素含量分别为 0.218，0.223，0.240，0.235，0.236，0.238 mg／g。可见，30 min 后，提取量无明显变化，故提取时间确定为30 min。