一测多评法测定参芪扶正注射液中苯丙素苷类和核苷类成分含量
2020-10-16何昌雄
何昌雄
(中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院,福建 福州 350000)
参芪扶正注射液是由党参和黄芪组方,2味中药材经水提取后与注射用氯化钠配制而成,具有益气扶正功效,用于肺脾气虚引起的神疲乏力、少气懒言、自汗眩晕,肺癌、胃癌见上述证候者的辅助治疗[1]。其含有苯丙素苷类、核苷类、皂苷类、糖类等活性成分,苯丙素苷类和核苷类成分有较好的免疫调节作用,在抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳等方面有较好的药理作用[2-4]。参考文献[5-7],考虑到多指标质量控制需要的对照品种类和量较大,本研究中以参芪扶正注射液中的党参苷Ⅰ和鸟苷为内标物,分别建立2种成分与党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、尿苷、腺苷间的相对校正因子,采用一测多评法(QAMS)同时测定参芪扶正注射液中8种成分的含量。QAMS法是在多指标质量控制时,以药材中易得、价廉、稳定的对照品的典型有效成分为内标物,建立该有效成分与其他成分间的相对校正因子,再通过校正因子计算出其他成分的含量。在方法实施时,可在只有1个对照品而其余对照品不足的情况下,可实现多种组分的同步含量测定,弥补了中药制剂含量测定过程中需要对照品品种多且不易获得的缺陷,已广泛应用于多种药物活性成分的定量测定[8-9]。本研究中考察了所建立的相对校正因子在不同仪器及不同试验条件下的重现性;采用相对保留时间定位法对各待测成分色谱峰进行定位;用t检验比较QAMS法和高效液相色谱(HPLC)外标(ESM)法测定的结果,对将QAMS应用于参芪扶正注射液多组分的含量测定进行了较全面的考察。现报道如下。
1 仪器与试药
仪器:Waters 2695型高效液相色谱仪,包括2695 Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自动进样器、Empower 3色谱工作站、2998二极管阵列检测器(美国Waters公司);1260 Infinity型高效液相色谱仪,包括G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、Agilent EZchrom色谱工作站、G4212B二极管阵列检测器(美国Agilent公司);AUW-220D型电子天平(日本岛津公司,精度为0.01 mg);KQ-250DB型数控超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司,功率为500 W,频率为40 kHz);Milli-Q Academic超纯水系统(美国默克密理博公司)。
色谱柱:ShimadzuVP-ODSC18液相色谱柱(250mm×4.6 mm,5 μm);Waters Sunfire ODS C18液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);Agilent Zorbax-C18液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);Hypersil ODS C18液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)。
试药:参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂,批号分别为 1802115 /1,1803222 /2,1804105 /1,1805261 /2,1806162 /1,1809052 /2,规格为每瓶 250 mL);党参苷Ⅰ对照品(批号为6257-45,含量为98%),党参苷Ⅱ对照品(批号为6257-73,含量为96.8%),党参苷Ⅳ对照品(批号为 6257-82,含量为 97.6% ),丁香苷对照品(批号为 5124-11,含量为98.2%),胞苷对照品(批号为MUST-20151212,含量为 98.5%),均购自四川省成都曼思特公司;尿苷对照品(批号为110887-201803,含量为 99.5%,4℃冷藏保存),腺苷对照品(批号为110879-201703,含量为 99.7% ,4 ℃冷藏保存),鸟苷对照品(批号为 111977-201501,含量为 93.6%),均购自中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Merk公司,批号分别为1910318,191117);水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
混合对照品溶液:取党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷对照品适量,精密称定,分别加甲醇制成每1 mL含党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷 0.2156,0.1707,0.155 8,0.100 3 mg 的对照品混合溶液,即得苯丙素苷类成分混合对照品溶液。取胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷对照品适量,精密称定,分别加纯净水制成每1 mL含胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷 0.090 4,0.148 6,0.118 4,0.120 3 mg的对照品混合溶液,即得核苷类成分混合对照品溶液。
供试品溶液:精密量取样品50 mL,置200 mL棕色容量瓶中,加甲醇约120 mL,密塞,置冰箱(2~10℃)中浸渍过夜。精密量取样品参芪扶正注射液25 mL,加在活化过的大孔树脂上,用30%乙醇100 mL洗脱,收集洗脱液,浓缩至干,残渣加流动相使溶解,转移至10 mL棕色容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得苯丙素苷类成分供试品溶液。避光操作。精密量取样品50 mL,置200 mL容量瓶中,加纯净水约120 mL,密塞,超声处理(功率为500 W,频率为 40 kHz)40 min,放冷,加纯净水定容,经 0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得核苷类成分供试品溶液。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件[10-13]与系统适用性试验
苯丙素苷类成分:色谱柱为Agilent Zorbax-C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈 -0.3% 甲酸溶液(39 ∶61,V/V);流速为 1.0 mL /min;UV 检测器检测波长为268 nm;柱温为35℃。
核苷类成分:色谱柱为Agilent Zorbax-C18柱(250mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇 -水(65 ∶35,V/V);流速为 1.0 mL/min;UV检测器检测波长为260 nm;柱温为35℃。
取混合对照品溶液及供试品溶液各10 μL,按拟订色谱条件进样测定。色谱图见图1。
图1 高效液相色谱图
2.2.2 方法学考察
线性关系考察:精密量取苯丙素苷类及核苷类成分混合对照品溶液 0.2,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0 mL,分别置10 mL容量瓶中,用甲醇及纯净水逐步稀释,定容,经0.45 μm 微孔滤膜滤过,按拟订色谱条件进样 10 μL,记录色谱图。以对照品质量浓度(X,μg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得各组分回归方程及线性范围。结果表明,各成分在各自线性范围内与峰面
积线性关系良好。取峰面积的信噪比(S/N)为10倍时的对照品质量浓度为定量限(LOQ)。结果见表1。
表1 各成分线性关系和定量限考察结果(n=6)
精密度试验:精密吸取苯丙素苷类和核苷类成分混合对照品溶液10 μL,连续进样6次,按拟订色谱条件进样测定,记录色谱峰峰面积。结果党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷峰面积的RSD分 别 为 0.91% ,0.65% ,0.73% ,0.82% 和1.01%,0.54%,0.91% ,0.72% (n=6),表明仪器精密度良好。
稳定性试验:取样品(批号为1806162/1),依法制备供试品溶液,分别于 0,3,6,9,12,20,24 h 时进样 10 μL,按拟订色谱条件测定,记录色谱峰峰面积。结果党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷峰面积的RSD分别为 1.03%,1.22%,1.13%,0.94%和 0.85%,0.91%,1.12%,1.04%(n=6),表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。
重复性试验:取样品(批号为1806162/1),依法平行制备6份供试品溶液,每份精密吸取10 μL,按拟订色谱条件进样测定。结果党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷峰面积的RSD分别为0.96% ,0.73% ,0.62% ,0.51% 和 0.75% ,0.64% ,0.93%,0.87%(n=6),表明方法重复性较好。
加样回收试验:精密量取已知含量的样品(批号为1806162/1)6份,每份 25 mL,分别精密加入党参苷Ⅰ(0.215 6 mg/mL)、党参苷Ⅱ(0.170 7 mg/mL)、党参苷Ⅳ(0.155 8 mg/mL)、丁香苷(0.100 3 mg /mL)混合对照品溶液各 2.0,2.5,3.0 mL,依法制备苯丙素苷类成分供试品溶液,精密吸取10 μL,按拟订色谱条件测定,计算加样回收率。结果见表2。精密量取已知含量的样品(批号为 1806162/1)6 份,每份 25 mL,分别精密加入胞苷 (0.215 6 mg/mL)、鸟 苷 (0.215 6 mg/mL)、尿 苷(0.215 6 mg /mL)、腺苷(0.215 6 mg /mL)混合对照品溶液各 1.5,2.0,2.5 mL,依法制备核苷类成分供试品溶液,精密吸取10 μL,按拟订色谱条件测定,计算加样回收率。结果见表3。
表2 4种苯丙素苷类成分加样回收试验结果(n=6)
2.3 校正因子重现性考察及各组分色谱峰定位
校正因子的计算:以党参苷Ⅰ和鸟苷为内标物,在2个不同的实验室分别对党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、尿苷、腺苷的校正因子按公式 [fk/w=fk/fw=(Wk×Am)/(Wm×Ak)]计算,式中Ak为内标物峰面积,Wk为内标物浓度;Am为其他组分峰面积,Wm为其他组分浓度)进行复核计算。结果表明,2个实验室间的差异不明显(RSD<0.50%)。详见表 4。
不同仪器及色谱柱的影响:考察了不同仪器和不同色谱柱对相对校对因子的影响,结果表明,所得相对校正因子差异不明显(RSD<0.60%)。详见表5。
不同柱温的影响:在不同的实验室,采用Waters 2695型高效液相色谱系统、Agilent Zorbax-C18色谱柱进行试验,分别考察不同柱温对相对校正因子的影响,结果表明,柱温对相对校正因子的影响不显著(RSD<0.50%)。详见表6。
不同流速的影响:在同一实验室,采用Waters 2695型高效液相色谱系统、Agilent Zorbax-C18色谱柱进行试验,分别考察不同流速对相对校正因子的影响,结果表明,流速对相对校正因子的影响不显著(RSD<0.50%)。详见表7。
表3 4种核苷类成分加样回收试验结果(n=6)
待测组分色谱峰定位:查阅文献[14-15],相对保留时间定位法优于保留时间差定位法,本试验中分别考察了采用不同色谱仪及色谱柱时,党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷色谱峰与党参苷Ⅰ色谱峰的相对保留时间及胞苷、尿苷、腺苷色谱峰与鸟苷色谱峰的相对保留时间。结果表明,不同色谱仪及色谱柱所测得的各组分相对保留时间无显著差异(RSD<0.50%)。详见表8。
表4 苯丙素苷类与核苷类成分在不同实验室测得的相对校正因子
2.4 QAMS法与ESM法测定结果的比较
采用QAMS法和ESM法测定6批样品(批号分别为1802115/1,1803222/2,1804105/1,1805261/2,1806162/1,1809052/2)含量。依法制备苯丙素苷类和核苷类成分供试品溶液,按拟订色谱条件进样测定,分别采用ESM法和QAMS法计算参芪扶正注射液中各成分的含量,并对测定结果行t检验。结果表明,2种方法无显著差异,详见表9。
表5 不同仪器及色谱柱相对校正因子耐用性考察结果
表6 不同柱温相对校正因子耐用性考察结果
3 讨论
3.1 色谱条件选择
检测波长确定:本试验中在190~400 nm波长段分别扫描8种活性成分对照品溶液,结果党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷4种苯丙素苷类成分的最大吸收波长为268 nm,胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷4种核苷类成分的最大吸收波长为260 nm,为保证各成分都具有适宜的灵敏度和精密度,试验中采用2套光谱检测波长,保证均在最佳吸收波长处检测8种成分。
流动相选择:根据待测组分理化性质和结构的差异,本试验中分别采用2组流动相进行分离。由于核苷类成分(胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷)极性大,易溶于水,故采用甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等度洗脱,各色谱峰均可被检出,与相邻色谱峰分离效果较好,考虑乙腈较甲醇毒性大,易污染环境,且价格高,故选择甲醇-水溶液等度洗脱作为本试验的流动相检测核苷类成分。为使党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷4种苯丙素苷类成分得到良好分离,采用乙腈-0.3%甲酸溶液(39∶61,V/V)等度洗脱,优化洗脱条件,实现同时检测出4种活性成分,该色谱条件下系统适用性均符合要求。
表7 不同流速相对校正因子耐用性考察结果
表8 不同色谱仪及色谱柱相对保留时间比较
3.2 QAMS法内标物选择
党参苷Ⅰ和鸟苷在参芪扶正注射液中含量较高,性质稳定,便宜,易得,是实验室常用对照品,符合QAMS法对参照物的要求,故分别以党参苷Ⅰ和鸟苷作为内标物,经上述方法学考察,方法切实可行。
3.3 相对校正因子的重现性
考察了不同仪器、色谱柱、柱温及流速对相对校正因子的影响,结果表明,各校正因子在以上不同条件下重现性均良好,QAMS法用于分析样品中各成分的通用性较好,可在不同实验室条件下进行含量检测。
3.4 QAMS法色谱峰定位
中药成分复杂,在不同色谱系统中会出现不同的色谱峰,在同一色谱系统中,其色谱峰的出峰时间、数量等也会受到色谱柱、柱温等诸多因素的影响,因此待测成分色谱峰的定位至关重要。本试验中考察相对保留时间参数在不同品牌HPLC仪和不同品牌色谱柱中的重现性。结果表明,相对保留时间在不同色谱系统及色谱柱条件下波动相对较小,且重现性较好(RSD<0.50%)。
3.5 方法评价
本研究中建立了测定参芪扶正注射液中苯丙素苷类成分(党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、党参苷Ⅳ、丁香苷)和核苷类成分(胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷)的有效成分含量的QAMS法,该方法结果准确、简便有效、重现性高,可用于参芪扶正注射液中有效成分的含量测定。
表9 外标法与一测多评法测定8种有效成分含量结果(n=6,μg/mL)