A型肉毒毒素对带状疱疹后神经痛小鼠行为学反应的影响

2020-10-16王冬燕李国松汤样华

浙江医学 2020年18期

王冬燕李国松汤样华

带状疱疹后神经痛（postherpetic neuralgia，PHN）是带状疱疹最常见的并发症之一[1]。流行病学调查资料显示，约有20%的带状疱疹患者在发病后3个月报告有PHN发生，且发生率随年龄增加而升高[2-3]。PHN因疼痛较为剧烈、病程长，导致患者伴有焦虑和抑郁等精神症状，严重影响患者的生活质量。治疗主要采用抗抑郁、抗癫痫、镇痛药等，需要长期甚至终身服药，且不良反应较多。非药物疗法如脊髓电刺激、神经阻滞与毁损、皮内注药疗法等，有严重并发症的可能，且部分疗法因患者个体差异而安全性和有效性不尽人意。近年来，文献报道应用A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTX-A）皮下注射可有效治疗PHN[4-6]。BTX-A是肉毒杆菌在繁殖中分泌的一种有毒性的蛋白质，可通过阻断神经递质在突触前膜的释放，以减轻神经病理性痛。但关于BTX-A治疗PHN的作用机制尚不明确。本研究拟构建PHN小鼠动物模型，通过注射BTX-A进行干预，观察BTX-A对PHN小鼠模型行为学反应的影响，为BTX-A临床治疗PHN提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物选取SPF级8周龄雄性C57小鼠（18～22 g）36只，由上海中医药大学动物中心提供，合格证号：SCXK（沪）2003-0003。每天光照、黑暗各12 h规律交替饲养，室温25℃，湿度60%～70%。所有动物自由饮水、进食。

1.2 主要试剂和仪器 BTX-A（20170928,规格100 U/支，兰州生物制品研究所）、紫外分光光度计（BECKMANDU800，美国BECKMAN公司）、GIS凝胶图像处理系统（Tanon-1600，上海天能科技有限公司）、显微镜（日本OLYMPUS公司）、Odyssey红外成像系统（LI-COR，日本OLYMPUS公司）。

1.3 动物模型的建立与小鼠分组小鼠腹腔内注射1%戊巴比妥钠溶液50 mg/kg麻醉后，将左下肢和背部用化学脱毛剂脱毛并用清水冲洗脱毛部位。3 d后，选取脱毛区光滑无损伤动物进入实验，皮肤损伤的动物剔除，以同等数量的小鼠补齐。然后分别于每只小鼠左下肢胫骨局部处用微量加样器皮下接种Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）10 μl（浓度1×106PFU/ml）。选择造模成功的PHN小鼠36只，随机分为3组，即对照组、BTX-A组和背根神经节（DRG）/BTX-A组，每组12只。在疱疹局部注射0.9%氯化钠注射液1 ml为对照组，疱疹局部和第5腰椎DRG处注射BTX-A（2 U/ml）1 ml为BTXA组和DRG/BTX-A组，1次/d，连续7 d。

1.4 行为学测试分别于注射前（Z0）和注射后第1、3、5、7 天（Z1、Z3、Z5、Z7）观察各组小鼠疼痛行为学反应，检测机械痛阈值和热痛阈值。

1.4.1 机械痛阈值检测采用von Frey测试小鼠缩足机械痛阈值：将小鼠随机置于底部为铁丝网（网格孔径为1 cm×1 cm）的鼠笼内，待小鼠在笼中适应30 min后，采用von Frey纤维丝以从低到高的力度（力度梯度：0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0 g）垂直刺激小鼠双侧后足足底中部。首先选用2.0 g力度的细丝，当该力度的刺激不能引起阳性反应（抬足或舔足行为）时，则给予相邻的大一级力度的刺激；若为阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，每只小鼠连续刺激5次，每次间隔10 s，5次刺激中有3次出现阳性反应则记为阳性结果，取出现3次阳性反应中的最低刺激力度则记为该小鼠机械痛阈值。

1.4.2 热痛阈值检测将各组小鼠依次置于热痛阈检测盒中，待其安静后，打开辐射光源，依次在其足趾与足掌上选择3个照射点，每个间距0.2 cm，每次照射间隔时间3 min。当小鼠出现嘶吼、舔足、甩尾及弹腿任一行为时记录所需照射的时间。3个照射点的平均值为小鼠最终热痛阈值。每次照射时间均不能＞30 s，防止长时间照射导致热烫伤。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；组内不同时间点比较采用重复测量数据的方差分析，两两比较采用Bonferoni校正的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠机械痛阈值检测结果比较与Z0时比较，对照组在 Z1、Z3、Z5、Z7时的机械痛阈值均无明显改变，差异均无统计学意义（均 P ＞0.05）。在 Z0、Z1、Z3时，3组间机械痛阈值比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。在Z5和Z7时，BTX-A组和DRG/BTX-A组小鼠机械痛阈值均明显高于对照组（均P＜0.05），但BTXA组、DRG/BTX-A组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。提示BTX-A能提高小鼠的机械痛阈值水平。

2.2 3组小鼠热痛阈值检测结果比较与Z0时比较，对照组在 Z1、Z3、Z5、Z7时的热痛阈值均无明显改变，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。在Z0、Z1时，3组间热痛阈值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在Z3、Z5和Z7时，BTX-A组和DRG/BTX-A组小鼠热痛阈值均明显低于对照组（均P＜0.05），但BTX-A组、DRG/BTX-A组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。提示BTX-A能降低小鼠的热痛阈值水平。

表1 各组小鼠不同时间点机械痛阈值变化（g）

3 讨论

国内外文献报道，目前临床上应用BTX-A治疗PHN镇痛效果明显，是一种潜在的可用于治疗PHN的可靠方法[7-8]。但是作为一种运动神经的特异性阻滞剂，BTX-A治疗PHN的内在机制仍不清楚。因此，需要大量的基础及临床研究来揭示BTX-A治疗PHN的作用机制，以更准确和更有效地指导临床治疗。

本研究采用胫骨局部处用微量加样器皮下接种注射HSV-1成功完成了PHN动物模型，该方法具有损伤小、操作简单便捷、可重复性高等优点，且注射后产生的局部机械痛阈值和热痛阈值变化更接近人体的病理过程，与文献报道相符[9]。故该动物模型用于本实验研究具有良好的可行性和确切性。

研究认为PHN主要是因三叉神经分支或脊髓神经节的神经胞体损伤所导致患者痛觉及其敏感度增加，出现疼痛剧烈不适反应[10]。实验研究还发现神经病理性疼痛发生发展过程中，脊髓内炎症小体核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1和半胱氨酸蛋白酶-1的激活促进了脊髓IL-1β的成熟释放，维持了中枢敏化以及神经炎症，进而表现为机械痛和热痛的过敏反应[11]。行为学反应是动物疼痛刺激的主要表现，而机械痛阈值和热痛阈值是疼痛行为学反应的主要检测指标，目前已经广泛应用于病理性神经痛实验研究中[12-13]。本实验机械痛阈值及热痛阈值检测结果分析显示，疱疹局部注射BTXA和第5腰椎DRG处注射BTX-A组相比较于局部注射0.9%氯化钠注射液，机械痛阈值明显升高，热痛阈值明显下降，且随时间的延长，效果表现也越明显，说明BTX-A可以有效改善PHN产生的自发性疼痛行为。