UPLC-MSMS法同时测定炎可宁片中5种成分的含量

张 丹，岳 磊

(郑州市食品药品检验所，河南 郑州 450006)

炎可宁片由黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、黄连5味中药组成，具有清热泻火、消炎止痢的功效，用于急性扁桃体炎、细菌性肺炎等[1]。目前，炎可宁片的质量标准较多，但鉴别专属性较差，无含量测定；或仅有针对个别药味的鉴别和含量测定，未包含所有药味。炎可宁片中含有多个药味，每个药味又含有多种化学成分[2-6]，药品质量需要全面控制。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法来控制中成药质量，可同时测定多种成分，可不要求被测成分完全分离，且具有更高的专属性和灵敏度[7-9]。本研究采用UPLC-MS/MS法对炎可宁片中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的含量测定方法进行考察和优化，大大提高了检测效率和准确度，为炎可宁片质量标准的完善提供了有力支撑。

1 药品、试剂与仪器

炎可宁片为吉林吉春制药股份有限公司产品(批号150703，161001，161002)、四川省三星堆制药有限公司产品(批号160909，170207，170211)、四川省旺林堂药业有限公司产品(批号161202，170201)、太极集团四川绵阳制药有限公司产品(批号1609003)、辽宁金丹药业有限公司产品(批号20160401)。黄芩苷对照品(纯度93.5%，批号110715-201619，)、盐酸小檗碱对照品(纯度86.7%，批号110713-201814)、盐酸黄柏碱对照品(纯度93.9%，批号111895-201202)、腺苷对照品 (纯度100%，批号110879-200202)、大黄素对照品(纯度98.7%，批号110756-201512)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，均为德国默克公司产品；甲酸为质谱纯，美国Fisher公司产品；水为纯净水。ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪，美国Waters公司产品；4000 QTrap 质谱分析仪，美国Absciex公司产品；XS205DU电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司产品；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEN C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈(A)-体积分数1 mL /L甲酸溶液(B)，体积流量0.3 mL/min,柱温30 ℃,进样量1 μL。梯度洗脱程序：0-3 min，20%→90%A；3-4 min，90%A；4-4.5 min，90%→20%A。

2.1.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正、负离子切换模式扫描，多重反应监测模式(MRM)，源喷射电压：5 500 V(正离子模式)，-4 500 V(负离子模式)；源温度550 ℃；雾化气(GAS1,GAS2)压力50 psi，气帘气压力(CAD)20 psi，碰撞反应气为氮气。5个待测成分的质谱参数见表1。

表1 黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷和大黄素的质谱参数

2.2 混合对照品溶液制备

精密称取黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素对照品适量，分别置于适合的量瓶中；取适量体积置同一个10 mL量瓶中，加甲醇制成混合对照品贮备溶液。精密量取上述混合对照品贮备溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成混合对照品溶液，质量分数分别为19.578 9,2.049 6,0.245 3,0.050 9 ,0.050 9 mg/L。

2.3 供试品溶液制备

取本品10片，除去包衣，研细，取约0. 1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入体积分数700 mL/L甲醇50 mL，称定质量，超声30 min，放至室温，再称定质量，用700 mL/L 甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液制备

将空白辅料，按炎可宁片的处方比例混合，按照炎可宁片的制备工艺制得阴性对照样品，按2.3项下的方法制备阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

按2.1项下的色谱与质谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各1 μL，进样测定，结果见图1。结果显示：阴性对照溶液在各成分提取离子流图的相应位置上没有干扰，专属性强。

1.腺苷；2.盐酸黄柏碱；3.黄芩苷； 4.盐酸小檗碱； 5.大黄素 A.对照品溶液； B.供试品溶液；C .阴性对照溶液 图1 5种成分的提取离子流图

2.6 线性关系考察

精密量取2.2项下的混合对照品贮备溶液0.1，0.5，1，5 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列浓度对照品溶液，进样分析。以对照品质量分数为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行回归，再分别以信噪比S/n=3、S/n=10时的质量分数作为检测限和定量限，结果见表2。结果表明：各成分在各自范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验

取2.2项下的混合对照品溶液，连续进样6次。结果：黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素峰面积的RSD分别为1.37%、2.21%、2.42%、4.59%、4.33%。结果表明：该方法的精密度符合要求。

表2 线性关系、检测限和定量限

2.8 重复性试验

取批号为150703的炎可宁片细粉各6分，平行制备6份供试品溶液，进样测定。结果测得黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的平均含量依次为1.080，1.800，0.342，0.0091，0.048 mg/片，其RSD依次为2.12%、2.38%、2.58%、4.87%、3.66%。结果表明：本方法重复性符合要求。

2.9 稳定性试验

取同一份批号为150703的供试品溶液，在室温下放置0,2,4,6,8,10,12 h后测定。结果:黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素峰面积的RSD依次为2.30%、2.62%、2.76%、4.03%、2.59%。结果表明：该供试品溶液在12 h内稳定。

2.10 加样回收率试验

取同一批炎可宁片(批号150703)，分别精密称取6份0.05 g细粉，分别精密加入混合对照品贮备溶液适量，平行制备6份加标供试品溶液，计算加样回收率。结果：黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、腺苷、大黄素的平均加样回收率依次为96.63%、96.70%、93.16%、87.58%、90.27%，其RSD依次为2.42%、2.56%、3.12%、2.95%、2.84% 。

2.11 供试品含量测定

分别取10批炎可宁片，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，通过回归方程计算含量，结果见表3。

表3 供试品中黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、 腺苷、大黄素含量的测定结果n=6，mg·片-1

3 讨 论

3.1 目标化合物的选择

炎可宁片现行的质量标准较多，但在鉴别和含量测定中均未涉及板蓝根中的化学成分，即未对炎可宁中板蓝根这一药味进行质量控制。本试验考察了板蓝根中的多个指标性成分。《中国药典》2015版一部中含有板蓝根的中成药将(R,S)-告依春作为指标性成分，但炎可宁片中(R,S)-告依春的含量非常小。靛玉红是板蓝根中的主要成分，但水溶性较差，在炎可宁片中的含量也极低。腺苷等核苷类成分在板蓝根中的含量比较高，对板蓝根及其制剂的品质影响较大，因此选取了腺苷作为指标性成分。本实验从炎可宁片每一味中药中选取了一种指标选成分，这5种化合物包含了黄酮、生物碱、核苷和蒽醌类4种结构类型，对炎可宁片进行较全面的质量控制研究。

3.2 供试品提取方法的考察

本研究分别对提取方式、提取溶剂、提取时间进行研究和优化。对于提取方式，笔者分别考察了超声和回流，鉴于两者的提取率差异不大，超声提取的操作较简便，故选择超声的提取方式。对于提取溶剂，笔者分别考察了甲醇、500 mL/L甲醇、700 mL/L甲醇、900 mL/L甲醇，结果以700 mL/L甲醇的提取率较高。对于提取时间，笔者分别考察了20 min、30 min、40 min，结果显示30 min的提取率明显高于20 min，但与40 min的无明显差异。为了节省时间，笔者选择提取时间为30 min。最终确定供试品提取方法是700 mL/L 甲醇超声提取30 min。

3.3 色谱条件的优化

对于流动相，笔者分别采用相同比例的甲醇-水、甲醇-1 mL/L甲酸、乙腈-水、乙腈-1 mL/L甲酸进行试验。结果显示，乙腈比甲醇的洗脱能力更强，各化合物的保留时间较合适。与纯水相比，一定体积分数的甲酸溶液可使这5种化合物的信号响应明显增强，且使峰形更加对称。对甲酸的体积分数进行优化时，显示：当体积分数为1 mL/L时，流动相的洗脱能力更强，信号响应更高。采用梯度洗脱方式是考虑到其可有效提高洗脱能力和分离效率，缩短分析时间。因此，选择乙腈-1 mL/L甲酸作为流动相，采用梯度洗脱方式进行试验。

综上所述，本研究建立了UPLC-MS/MS同时测定炎可宁片中5个成分含量的方法。该方法灵敏度高，重复性好，专属性强，测定迅速，结果准确。与现行质量标准相比，该方法能提高检测效率和准确度，可为炎可宁片质量标准的进一步完善提供可靠依据。