藏药灰兜巴对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的改善作用

杨坤宝 ，庞宗然，尹长江，白颖慧，鲁碧楠，于 宁，韩桂艳

（1.中央民族大学药学院，北京 100081；2.承德医学院，河北 承德 067000；3.承德医学院附属医院，河北 承德 067000）

2017 年底，国际糖尿病联盟公布了第八版全球糖尿病地图。全球糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）成人患者（20～79 岁）到2017 年已达到4.25 亿，预计到2045 年，糖尿病患者可能达到6.42 亿。其中我国患病人口最多，高达1.144 亿［1］。而糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）作为糖尿病最常见微血管并发症，目前已成为导致终末期肾病（End-stage renal disease，ESRD）的最主要原因之一［2］。北大医院最新统计结果显示，我国DN 已经超过了肾小球肾炎相关慢性肾脏病，成为ESRD 的首要病因，估计患病人数已达2 400 万［3］。目前临床治疗糖尿病肾病多以控制血糖、血压为主，但并不能完全阻止其进展。因此，深入研究糖尿病肾病发病机制并寻找新的天然药物，对于减缓该疾病发生发展具有重要意义。

藏药灰兜巴又名灰蔸巴、闭口袋，为地蛛科地蛛属卡氏地蛛（Atypus karschiDoenitz）在老茶树根部所筑的巢穴，具有益气健脾、滋补肾阴之功效，在四川峨眉山地区被世代相传，用于糖尿病及其并发症的治疗［4］。本实验研究发现，灰兜巴可改善糖尿病肾病大鼠肾组织病理学及足细胞超微结构改变，减少足细胞丢失，降低蛋白尿。

1 材料

1.1 动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠32 只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2016-0011，5 周龄，体质量120～140 g。饲养环境恒温22～24 ℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h 昼夜更替，本实验经承德医学院实验动物伦理委员会许可（实验动物伦理审查批号201712-007）。

1.2 药物与试剂 灰兜巴产于四川省峨眉山市双福镇，6 月中下旬采摘，晒制，经吉林农业大学李欣教授鉴定为正品，二甲双胍（1，1-二甲基双胍盐酸盐含有量98.8%，批号H20103205）由石家庄市普力制药有限公司馈赠；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（货号S0130）购自美国Sigma 公司；尿微量白蛋白（mAlb）测定试剂盒（货号E038-1-1）、尿肌酐（Ucr）测定试剂盒（货号C011-1-1）购自南京建成生物工程研究所；PASM 染色试剂盒（货号G1059）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；β-actin 鼠单克隆抗体（货号AF0003）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（通用型，50X，货号P1045）、预染蛋白质分子量标准（19-117kD，货号P0066）、RIPA 裂解液（强，货号P0013B）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型，货号P0010）、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（货号P0 012 A）、BeyoECL Plus（超敏ECL 化学发光试剂盒）（货号P0018）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（货号P0015）、PVDF 膜（0.45 μm，26.5 cm×3.75 m，货号IPVH00010）均购自碧云天生物技术有限公司；Nephrin（B-12）小鼠单克隆抗体（货号sc-377246）购自美国圣克鲁斯生物技术有限公司；山羊抗小鼠IGG（H＆L）二抗（CY3 标记，货号GB21301）、DAPI 染色试剂（货号G1012）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；50%葡萄糖（武汉市福星生物药业有限公司，国药准字H42022230）。

1.3 仪器 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；BK200 全自动生化分析仪（山东博科生物产业有限公司）；ES 自动组织脱水机（美国Thermo公司）；Histocentre 3 组织包埋机（美国Thermo 公司）；RM 2125 轮转式切片机（德国Leica 公司），TK-218 型恒温摊片烤片机（湖北泰维医疗科技有限责任公司）；MDF-U4086 超低温冰箱（日本三洋公司）；Eclipse Ti-SR 倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；DS-Ri1-U3 数码显微成像系统（日本Nikon公司）；SDS-PAGE 电泳仪（北京六一厂）；转膜仪（北京六一厂）；Tanon-5200 化学发光凝胶成像系统（天能科技有限公司）；HT7700 型透射电子显微镜（日本Hitachi 公司）；强生稳豪倍易型血糖仪［强生（中国）医疗器材有限公司］。

2 方法

2.1 药物制备 灰兜巴水提物制备，根据当地用药方式，总结灰兜巴制备工艺参数［4］，并结合预实验研究结果，委托承德颈复康药业集团有限公司加工制备。取灰兜巴10 kg，分别加入药材量10、9、9 倍量的水，药材浸泡 2 h，沸腾回流（100 ℃）提取3 次，2 h/次；收集提取液，70 ℃减压浓缩至适当的相对密度（1.02），放至室温，加入乙醇至乙醇浓度为80%，4 ℃醇沉12 h，过100 目筛，收集水提醇沉部分，真空减压干燥得灰兜巴水提醇沉物，本次灰兜巴生药提取率为2.54%。冰上配置1% STZ（10 mg STZ 溶于1 mL柠檬酸柠檬酸钠缓冲液）后用锡纸包裹，并在15 min内使用。

2.2 糖尿病肾病模型制备 SD 大鼠适应性喂养1周后，随机选取8 只进入对照组并饲以SPF 级大鼠维持饲料（定义为0 周），其余大鼠以高脂高糖饲料（66.5%大小鼠维持饲料+10% 猪油+20% 蔗糖+2.5%胆固醇+1%胆酸钠）喂养，6 周后禁食不禁水4 h，一次性腹腔注射1% STZ（65 mg/kg），对照组注射等体积溶媒。注射1 周后禁食不禁水12 h，进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT），50% 葡萄糖备用，用于低血糖昏迷灌胃抢救。以空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）≥11.1 mmol/L［5-7］，OGTT 实 验AUC 升高2 倍，视为造模成功。采用随机数字表法将造模成功大鼠分为模型组（n＝8），二甲双胍组（n＝8），灰兜巴组（n＝8）。

2.3 给药 课题组前期糖尿病肾病大鼠动物预实验结合灰兜巴当地用药量设计灰兜巴水提物冻干粉高、中、低剂量组，其中以高剂量组（180 mg/kg）效果最为明显，确定灰兜巴组给药剂量（180 mg/kg）。参考魏伟主编第4 版《药理实验方法学》，按种属间体表面积换算大鼠二甲双胍等效剂量为45 mg/kg。用0.5% 羟甲基纤维素钠（CMC-Na）混悬灰兜巴水提醇沉物冻干粉和二甲双胍粉末，按1 mL/100 g 灌胃给药。对照组和模型组每天于固定时间灌胃等体积0.5% CMC-Na，灌胃6 d，休息1 d，如此连续干预6 周。

2.4 给药前后OGTT 实验 分别于药物干预前（第7 周）和药物干预后（第13 周）进行OGTT实验。禁食不禁水12 h，50% 葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，并于0、30、60、90、120 min，用强生稳豪血糖仪测尾尖血糖。根据近似梯形面积计算AUC（mmol/L·h）＝［（BG0+BG30）×0.5/2］+［（BG30+BG60）×0.5/2］+［（BG60+BG90）×0.5/2］+［（BG90+BG120）×0.5/2］（BG 分别代表糖负荷后各时间点的血糖值）。

2.5 全自动生化分析仪检测药物干预前后尿液mAlb/Ucr 分别于药物干预前后用代谢笼收集大鼠24 h 尿液，期间自由饮食。取1 mL 尿液于1.5 mL离心管中，4 ℃下2 000 r/min 离心10 min，取上清，全自动生化分析仪检测mAlb、Ucr，并计算二者比值。实验结束时，腹腔注射氯胺酮（10 mg/100 g）麻醉大鼠，脱颈椎法处死大鼠，剖腹取出肾脏，一侧用于组织病理学及超微结构观察，另一侧切小块后-80 ℃保存。

2.6 肾脏组织PASM 染色 4 ℃预冷生理盐水冲洗肾脏组织后投入10% 福尔马林中性固定液固定48 h，经充分流水冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。常规病理切片，厚度约4 μm，脱蜡至水，高碘酸染色，乌洛托品储备液孵育染色，显色以肾小球毛细血管基膜呈黑色为准，硫代硫酸钠处理，复染伊红，脱水封片，光镜下观察肾脏组织病理学改变。

2.7 Western blot肾组织匀浆液，4 ℃下7 500 r/min离心5 min，弃上清液。加PBS 溶液重复清洗2～3 次至组织无血色，按说明加入RIPA 裂解液（150～250 μL/20 mg），4 ℃下10 000 r/min离心20 min，取上清，按BCA 蛋白质定量试剂盒操作测定蛋白浓度。经煮蛋白、电泳、转膜、封闭，用TBST 溶液稀释一抗，4 ℃孵育过夜。TBST溶液洗膜后，加入与一抗对应来源的二抗室温慢摇孵育2 h，再用TBST 溶液洗膜，ECL 发光液进行显色，化学发光凝胶成像系统曝光。以β-actin 为内参分析Nephrin 蛋白相对表达量。

2.8 免疫荧光分析 肾组织石蜡切片约4 μm 厚，脱蜡至水，用EDTA 抗原修复缓冲液（pH ＝8.0）于微波炉内进行抗原修复，自发荧光淬灭，3%BSA 封闭。按说明书加入Nephrin 一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜。再加入与一抗相应种属的二抗，即山羊抗小鼠IGG（H＆L）二抗（CY3 标记），抗荧光淬灭封片剂封片，于尼康倒置荧光显微镜下采集图像。

2.9 透射电镜观察肾脏超微结构 肾脏组织修成1 mm3小块；3.1%戊二醛于4 ℃冰箱内固定2 h，1%锇酸后固定1 h，常规电镜样品包埋；半薄切片，光镜下定位选区；超薄切片，片厚60 nm，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜观察肾脏超微结构改变。校准后，选至少30 个点测量肾小球基底膜内层到外层的垂直距离，计算平均肾小球基底膜厚度（thickness of glomerular basement membrane，TGBM）。

2.10 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行分析。分析前进行数据正态性分布和方差同质性检验，方差齐则采用单因素方差分析；方差不齐或非正态，采用秩和检验；对OGTT 重复测量设计资料采用多因素方差分析；并采用LSD 法对多个样本均数进行两两比较。实验数据以（）表示，检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 药物干预前后OGTT 分析 药物干预前，与对照组比较，模型组、二甲双胍组和灰兜巴组大鼠AUC 升高（P＜0.01）；二甲双胍组和灰兜巴组AUC 与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。药物干预后，灰兜巴和二甲双胍均可改善糖尿病肾病大鼠空腹葡萄糖耐量受损情况，二甲双胍组、灰兜巴组AUC 低于模型组（P＜0.01）。见图1。

图1 药物干预前后OGTT 分析及AUC 比较（n=8）Fig.1 OGTT analysis and AUC comparison before and after medication（n=8）

3.2 给药前后mAlb/Ucr 比较 药物干预前，与对照组比较，模型组大鼠尿液 mAlb/Ucr 升高（P＜0.01）；二甲双胍组和灰兜巴组mAlb/Ucr 与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。药物干预后，二甲双胍组和灰兜巴组mAlb/Ucr 低于模型组（P＜0.01），且灰兜巴组mAlb/Ucr 低于二甲双胍组（P＜0.01），见图2。

图2 给药前后mAlb/Ucr 比较（n=8）Fig.2 Comparison of mAlb/Ucr before and after medication（n=8）

3.3 PASM 染色观察肾组织病理改变 肾组织石蜡切片经PASM 染色后，肾小球基底膜IV 胶原镀银呈黑色。模型组可见明显肾小球管丛系膜扩张伴基底膜增生。灰兜巴和二甲双胍可明显减轻肾小球病理改变（图3）。

3.4 肾组织Nephrin 蛋白表达 Western blot 结果显示，与对照组比较，模型组足细胞标志蛋白Nephrin 表达下降（P＜0.01），灰兜巴和二甲双胍可减轻模型大鼠足细胞Nephrin 下降情况（P＜0.05，P＜0.01），且灰兜巴组Nephrin 蛋白表达高于二甲双胍组（P＜0.01），见图4。

3.5 肾组织足细胞Nephrin 荧光检测 为验证Nephrin 蛋白表达结果，进行肾组织石蜡切片免疫荧光检测，观察肾小球足细胞丢失情况。免疫荧光检测结果显示，模型组大鼠肾小球足细胞标志蛋白Nephrin（CY3 标记）表达明显减少。灰兜巴和二甲双胍组可明显减轻足细胞Nephrin 下降情况（图5）。

图3 PASM 染色观察肾小球组织病理改变（×400）Fig.3 Pathological changes examined by PASM staining（×400）

图4 肾组织Nephrin 蛋白表达（n=3）Fig.4 Protein expression of Nephrin in kidney（n=3）

图5 肾组织Nephrin 免疫荧光检测（×200）Fig.5 Expression of Nephrin by immunofluorescence assay（×200）

3.6 透射电镜观察肾小球超微结构 利用透射电子显微镜观察足细胞和肾小球基底膜超微结构改变情况，进一步验证足细胞标志蛋白Nephrin 表达结果。对照组肾小球基底膜清晰，足细胞形态完整；模型组肾小球基底膜不规则增厚，足突广泛融合，足细胞可见明显线粒体嵴断裂或空泡化；灰兜巴和二甲双胍可明显改善肾小球基底膜增厚和足细胞足突融合情况（图6）。TGBM 测量结果进一步为上述观察提供佐证，与对照组比较，模型组TGBM增厚（P＜0.01）；灰兜巴组和二甲双胍组可改善TGBM 增厚情况，灰兜巴组TGBM 低于模型组和二甲双胍组（P＜0.01），见图7。

图6 电镜观察肾小球超微结构改变（×12 500）Fig.6 Ultrastructure changes under TEM（×12 500）

图7 肾小球平均基底膜厚度（n=3）Fig.7 Mean thickness of glomerular basement membrane（n=3）

4 讨论

现有研究报道多采用尾尖采血测空腹血糖或随机血糖作为成功造模判定标准［8-9］，但课题组预实验发现造模后大鼠血糖不稳定，存在造模成功，但检测时可能因发生低血糖反应，而未被检测出高血糖的情况；或造模不成功，存在一过性高血糖而被判定为造模成功的情况，因此单独以此为标准判定成模与否缺乏严谨性。本研究将空腹血糖检测结果与OGTT 分析结果结合起来，以空腹血糖大于11.1 mmol/L，且OGTT 时间-血糖曲线下面积升高2 倍，作为造模成功判定标准。实验结束时，灰兜巴组AUC 仍高于对照组，说明灰兜巴组大鼠仍存在2 h 葡萄糖耐量受损的情况。

有研究表明，在糖尿病肾病早期即出现不同程度足细胞损伤，因此，足细胞损伤在该疾病发病中的重要作用倍受关注［10-11］。足细胞即肾小球脏层上皮细胞，附着于肾小球基底膜外侧，参与构成肾小球滤过膜的最后一道屏障。Nephrin 为足细胞裂孔隔膜的主要成分，在糖尿病肾病患者中其表达明显下降，且下降程度与蛋白尿的进展呈正相关［12］。检测尿液mAlb/Ucr 发现，糖尿病肾病大鼠发生大量蛋白尿（＞30 μg/mg），课题组通过Western blot法和免疫荧光法检测进一步发现，大鼠肾小球Nephrin 表达明显减少，提示存在足细胞丢失，而灰兜巴可明显减轻糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞丢失情况，透射电镜观察结果与此相互印证。

更有趣的是，在透射电镜观察中发现模型组大鼠存在明显的线粒体嵴消失或空泡化。而新近研究表明，线粒体动力学在2 型糖尿病及其血管并发症中起着至关重要的作用，线粒体动力学失衡可致线粒体功能障碍，ATP 合成减少，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）减少，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）丢 失，最终以线粒体凋亡通路致足细胞凋亡，加速糖尿病肾病的发生发展［13-14］。强烈提示高糖环境所诱发的足细胞线粒体动力学失衡是否为导致足细胞凋亡、丢失的始动因素？ 这将为下一步从源头上挖掘灰兜巴发挥糖尿病肾病保护作用机制提供有价值线索。

此外，该实验结果表明，灰兜巴降糖效果虽然不如二甲双胍疗效显著，但其对糖尿病肾病大鼠的肾脏保护作用明显优于二甲双胍。中医理论认为，糖尿病肾脏病属于“消渴病-下消”范畴，消渴失治或治之不当，则致气阴两虚，脾肾两虚，日久则致气血阴阳俱虚，肾络瘀结、浊毒内停。临床治疗早期糖尿病肾病以益气养阴疗效较好［15］，该实验结果将进一步为临床应用益气养阴藏药灰兜巴治疗糖尿病肾病提供可靠实验依据。