猪miR-204组织表达与重要靶基因筛选

王 伟，滚双宝，2，*，王鹏飞，黄晓宇，谢开会，雒瑞瑞，高小莉，张 博，闫尊强，杨巧丽，马艳萍

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省现代养猪技术工程研究中心，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学 图书馆，甘肃 兰州 730070)

microRNAs(miRNAs)是一类短链非编码小RNA分子，长度约18～25 nt，广泛存在于动植物中，miRNAs发挥作用主要是与其靶基因mRNA 3′UTR种子区序列完全或不完全互补配对，从而降解靶mRNA或抑制其翻译，进而在转录后水平调控靶mRNA的表达[1-2]。截至2018年10月，miRBase数据库中注释的猪miRNA成熟体序列已达到858种，但是绝大多数miRNA功能却鲜有报道。随着高通量测序技术的兴起，可以对miRNA进行直接测序从而为发掘更多新的miRNA提供了可能，近年来国内外学者针对miRNA参与猪骨骼肌发育、脂肪生成及炎症性肠病等开展了大量研究[3-6]。已有研究表明，大肠埃希菌(Escherichiacoli)和沙门氏菌(Sallmonella)引起的仔猪腹泻与miRNA 的表达调控有关[7-9]。Dinh等[10]和Hong等[11]研究发现，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)感染后，马立克病易感的白来航鸡(White Leghorns)小肠和脾脏中miRNA的表达发生了显著变化，这说明miRNA在产气荚膜梭菌感染的肠道疾病中具有重要的调控作用。

本课题组基于前期建立的仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受和易感组群体，运用Illumina Hiseq4000测序平台，对仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受和易感组回肠组织中差异表达的mRNA进行了分析[12]，同时采用Illumina Solexa高通量测序技术，对仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受和易感组回肠组织中差异表达microRNAs进行了分析，通过数据分析，筛选出耐受和易感组中显著上调表达的miR-204[13]。目前研究已证实，miR-204能够在结直肠癌、乳腺癌、胃癌等疾病的发生发展过程中发挥重要作用[14-17]。本研究以7日龄仔猪为试验对象，检测miR-204在仔猪不同组织中的表达，同时对其成熟体序列保守性进行分析，进一步结合对其预测靶基因的GO和KEGG通路富集分析，对筛选到的关键靶基因在转录水平上进行初步验证，以期探讨miR-204在调控仔猪C型产气荚膜梭菌感染的分子调控机制，同时也为寻找仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染有效的遗传标记提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 组织样品

试验对象为7日龄长×大二元杂交仔猪(由甘肃定西西泰养殖有限公司提供)，方案参照文献[18]，选取30头体质量大体一致、健康的仔猪，随机挑选25头作为攻毒组，每天灌服C型产气荚膜梭菌C59-2菌株培养液(每头1 mL)，其余5头为对照组，试验期5 d。试验结束后，根据腹泻评分[19]，分为对照组(IC)、耐受组(IR)和易感组(IS)，每组5头，屠宰后采集组织样，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、空肠、回肠、胸腺和淋巴组织，液氮速冻保存，然后带回实验室-70 ℃超低温冰箱保存备用。

1.1.2 细胞系

本试验转染所用猪肠上皮细胞(IPEC-J2)购自北京北纳创联生物技术研究院，由本实验室保存培养。

1.2 实验试剂

TransZolUp购自北京全式金生物技术有限公司；miRNA一步法cDNA合成试剂盒Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit、mRNA反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、荧光定量试剂盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)购自宝生物(大连)生物有限公司；miR-204 mimics、miR-mimics NC由广州锐博生物技术有限公司合成； LipofectamineTM2000 Transfection Reagent购自于Invitrogen公司；DMEM/F12液体培养基、胰蛋白酶溶液、双抗均购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、无血清培养基Opti-MEMTMⅠ Reduced Serum Medium购自Gibco公司；引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3 总RNA提取及反转录

根据TransZolUp试剂盒说明书提取各组织和细胞总RNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测RNA浓度和纯度，检测合格后备用。按照Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit 反转录试剂盒说明书进行miRNA定量所需cDNA合成，反应总体系10 μL：5 μL mRQ Buffer (2×)，3.75 μL 总RNA，1.25 μL mRQ Enzyme，37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min，反应结束后10倍稀释备用。根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书合成mRNA定量所需cDNA，反转录体系20 μL：第一步去除基因组DNA反应，反应体系：5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，各组织的总RNA 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL，混匀后42℃ 2 min。第二步反转录反应，反应体系：第一步反应混合液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Free dH2O补足至20 μL，混匀后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃条件下保存。反应结束后，所得cDNA保存在-20 ℃条件下备用。

1.4 miR-204组织表达分析

采用实时荧光定量PCR方法检测ssc-miR-204在仔猪感染C型产气荚膜梭菌对照组(IC)、耐受组(IR)和易感组(IS)回肠组织中的表达量，同时检测其在心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、空肠、回肠、胸腺和淋巴11个组织中的表达量，以U6基因为内参，引物信息见表1。应用Light Cycler480 Ⅱ System进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为：TB Green Premix ExTaq(2×)10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板(100 ng·μL-1) 2 μL，RNase Free H2O补足至20 μL。反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s，(60±1) ℃，15 s；72 ℃， 20 s；40个循环。每个组织做3个样品重复，每个样品同批次做3个复孔。以2-ΔΔCt法计算相对表达量，数据用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，结果均以平均数±标准差表示。

表1 miRNA定量引物信息Table 1 miRNA quantitative primer information

1.5 miR-204(5p)不同物种间保守性分析

利用miRBase 数据库(http://www.mirbase.org/)下载人(Homosapiens)、猪(Susscrofa)、大鼠(Rattusnorvegicus)、猕猴(Macacamulatta)、牛(Bostaurus)、小鼠(Musmusculus)、大猩猩(Gorillagorilla)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、鸡(Gallusgallus)和鸭嘴兽(Ornithorhynchusanatinus)10个物种miR-204(5p)成熟体序列，用MEGA7.0软件进行序列比对，分析其保守性。

1.6 miR-204靶基因预测及功能富集分析

鉴于目前有关miRNA靶基因预测数据库并未注释到猪这一种属，因此根据其成熟体序列的保守性，搜索人的miRNA数据库预测靶基因。本试验采用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)和PicTar(https://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi)3款软件进行靶基因预测，利用Venny2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线软件求交集。利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)软件对miR-204预测的靶基因集进行基因本体论(gene ontology，GO)和KEGG pathway通路显著富集分析(P<0.05)。同时利用STRING 蛋白质相互作用数据库(http://string.embl.de/)进行靶基因蛋白质功能分析。

1.7 C型产气荚膜梭菌抗性相关靶基因筛选

基于3款生物信息学软件预测到的miR-204靶基因，利用Venny 2.1在线软件将其靶基因集合与本课题组前期利用高通量测序筛选出的仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受组与易感组中差异表达且与抗性相关的候选基因[12]取交集，进一步筛选出仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染抗性相关的关键靶基因。

1.8 细胞培养和转染

将猪肠上皮细胞(IPEC-J2)37 ℃水浴解冻复苏后，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，放置于37 ℃，5% CO2条件的培养箱中。传代数次，转染前将生长状态良好的细胞接种于6孔板，密度约每孔4×105个细胞，培养24 h后，按照LipofectamineTMReagent 2000和miRNA mimics说明书将miR-204 mimics 和miRNA mimics NC分别转染IPEC-J2细胞，每组设置3个重复，转染24 h后收集细胞，进行细胞RNA提取。

1.9 miR-204关键靶基因qRT-PCR验证

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测NR3C1、SIRT1、BCL2L2和DLG5四个关键靶基因mRNA表达量，以β-actin基因为内参，引物信息见表2。应用LightCycler480 Ⅱ System进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为：TB Green Premix ExTaq(2×)10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板(100 ng·μL-1)2 μL，RNase Free H2O补足至20 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。每个样品做3个重复，以2-ΔΔCt法计算相对表达量，数据用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，结果均以平均数±标准差表示。

表2 mRNA定量引物信息Table 2 mRNA quantitative primer information

2 结果与分析

2.1 miR-204组织表达检测

采用实时荧光定量PCR方法，检测了ssc-miR-204在仔猪感染C型产气荚膜梭菌对照组(IC)、耐受组(IR)和易感组(IS)回肠组织中的表达量，我们发现ssc-miR-204表达量在易感组极显著高于耐受组(P<0.01)，如(图1-B)所示，该结果与高通量测序结果趋势相一致(图1-A)，说明测序结果可靠。同时我们检测了ssc-miR-204在心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、空肠、回肠、胸腺和淋巴11个组织中的表达量，发现其在肾脏组织极显著高表达(P<0.01)，在肝脏、胸腺和淋巴等免疫器官中也显著高表达，在小肠各段组织中呈中高度表达(图1-C)。

2.2 miR-204(5p)不同物种间保守性分析

应用 miRBase 数据库检索出人、猪、大鼠、小鼠、牛、猕猴、大猩猩、家兔、鸡和鸭嘴兽10个物种miR-204(5p)的成熟体序列，进行比对分析，发现miR-204(5p)的成熟体序列“UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU”在脊椎动物之间高度保守(表3)。

表3 不同物种miR-204(5p)成熟体序列Table 3 Mature sequence of miR-204(5p) from multiple species

IC，对照组；IR，耐受组；IS，易感组；1-11分别代表心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、空肠、回肠、胸腺和淋巴。*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。柱上无相同大写字母的表示差异极显著(P<0.01)。下同。IC， Control group; IR， Resistance group; IS， sensitive group; 1-11 represented heart， liver， spleen， lung， kidney， stomach， duodenum， jejunum， ileum， thymus and lymph. * represented significant difference at the level of 0.05; ** represented significant difference at the level of 0.01. Bars marked withou the same capital letters represented signficant difference at the level of 0.01. The same as below.图1 miR-204在各组织中的表达分析Fig.1 Expression analysis of miR-204 in different tissues

2.3 miR-204靶基因预测及功能富集分析

本试验采用TargetScan、miRDB和PicTar三款软件进行靶基因预测，分别预测到791、1114和250个靶基因，利用Venny2.1在线软件求交集，共得到114个靶基因(图2)。将这114个共同靶基因作为靶基因集合，利用DAVID在线软件进行GO和KEGG富集分析，发现这些靶基因显著富集在15个GO功能(P<0.05)，包括11个生物学过程(biological process，BP)，1个细胞组分(cell components，CC)和3个分子功能(molecular function，MF)(表4)。KEGG信号通路富集分析发现，这些靶基因显著富集在13个信号通路(P<0.05)，包括一些与免疫炎症等疾病相关的通路(图3)。同时利用STRING数据库对靶基因蛋白进行了功能分类分析，发现这些靶基因蛋白按功能分为12类，主要包括细胞核、锌指结构和转运等生物学功能(图4)。

图2 miR-204靶基因预测Fig.2 The prediction of miR-204 target genes

图3 靶基因KEGG富集分析Fig.3 Enrichment analysis of target gene KEGG pathway

图4 靶蛋白功能分类Fig.4 Functional classification of target proteins

表4 靶基因GO功能富集Table 4 Enrichment analysis of target gene GO function

2.4 C型产气荚膜梭菌抗性相关靶基因筛选

根据预测得到的靶基因集，结合本课题组前期利用高通量测序筛选出的仔猪感染C型产气荚膜梭菌耐受组与易感组差异表达候选基因，我们发现了4个可能与仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染有关的重要靶基因：NR3C1、SIRT1、BCL2L2和DLG5，具体信息见表5。

表5 重要靶基因信息Table 5 Specific information of major target genes

2.5 重要靶基因qRT-PCR验证

将miR-204 mimics和miRNA mimics NC分别转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)，转染24 h后收集细胞，提取细胞RNA。我们采用实时荧光定量PCR方法检测了关键靶基因NR3C1、SIRT1、BCL2L2和DLG5在转染了miR-204 mimics后的表达量。发现在转染miR-204 mimics后，靶基因NR3C1上调表达(图5-A)，靶基因SIRT1、BCL2L2、DLG5的表达量相对于对照组极显著(P<0.01)下调表达(图5-B～D)。据此我们推测，ssc-miR-204可能靶向调控SIRT1、BCL2L2和DLG5基因。

图5 靶基因qRT-PCR验证Fig.5 The validation of target genes by qRT-PCR

3 讨论

随着分子克隆、基因芯片、小RNA 文库筛选、高通量测序等新型技术的出现，越来越多的miRNA可以通过预测和实验验证的方法被证实。miRNA起作用是通过调节相应靶基因的表达来实现，然而通过实验逐一验证的手段来研究miRNA靶基因会相当复杂和困难，原因在于1个miRNA可能作用于不同靶基因，也可能是多个miRNA调控相同靶基因[20]。因此，采用生物信息学软件预测，可以快速、高效的筛选miRNA靶基因，在miRNA研究中起着非常重要的作用。目前关于miRNA靶基因预测的研究，大多采用两种或两种以上的软件进行预测，然后求交集，目的是为了减少单个软件预测的假阳性，提高准确率。本研究利用TargetScan、miRDB、PicTar三种软件同时进行靶基因预测，方法可行，预测得到的114个靶基因，相对准确可靠，可以用于后续靶向关系验证。

大量的研究表明，miRNA的表达具有组织和时空特异性，这种特异性表达与其各自发挥的功能密切相关，Liang等[21]研究发现，ssc-miR-129-5p，ssc-miR-30和ssc-miR-150能够在猪脂肪组织中特异性表达；miR-135和miR-183在大白猪背膘中特异性表达[22]。Sharbati等[23]和吴正常等[24]研究表明，miR-215和miR-192在猪十二指肠、空肠段高度表达。本研究发现，miR-204在7日龄仔猪肾脏、肝脏、胸腺、淋巴、十二指肠和回肠组织中高度表达，这说明miR-204在与免疫炎症相关的组织器官中发挥重要作用。研究表明，腹泻是导致新生仔猪死亡的主要原因，仔猪腹泻的发生与遗传、病原微生物感染和饲养管理等密切相关。C型产气荚膜梭菌是引起仔猪腹泻的主要病原菌之一[25]，C型产气荚膜梭菌主要危害新生仔猪，且主要在小肠段寄生繁殖，引起仔猪腹泻。本研究采用C型产气荚膜梭菌感染的腹泻仔猪回肠组织进行高通量测序，筛选出的差异表达miR-204可能在仔猪感染C型产气荚膜梭菌引起的腹泻过程中发挥重要调控作用。

有关仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染抗病育种的研究相对较少，本课题组已在LncRNA、miRNA和CircRNA层面进行了相关研究[12-13，26]，但是具体有效的分子靶标并未得到证实。本研究通过对miR-204靶基因预测及qRT-PCR验证，初步筛选出SIRT1、BCL2L2和DLG5三个关键的靶基因，以期探索其在仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染中发挥的作用。SIRT1基因是乙酰化酶(Sirtuin1)家族的主要成员，与细胞能量代谢和维持形态密切相关[27]，有研究报道，SIRT1可以保护猪卵母细胞的衰老[28]；Zhang等[29]研究发现，miR-22通过靶向SIRT1抑制RASF滑膜成纤维细胞增殖和促炎细胞因子的产生。BCL2L2基因是细胞凋亡蛋白BCL2家族的成员，其能够结合Bim蛋白，促使细胞凋亡[30]。孔贺磊等[31]研究发现，绵羊痘病毒(SPPV)感染后，睾丸细胞外泌体源性oar-miR-10b通过靶向BCL2L2可以有效抵抗感染；Shi等[32]研究发现，上调表达的miR-29b可以通过靶向Bcl2L2抑制缺血脑损伤神经元细胞的死亡。DLG5基因是膜结合相关的鸟苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase，MAGUK)家族重要成员之一，其在调节细胞增殖分化、维持细胞骨架和上皮细胞完整性等过程中具有重要的作用[33]。DLG5基因的遗传变异与炎症性肠病存在密切关系[34]。吴嘉韵等[35]研究发现，产肠毒素性大肠埃希菌侵染猪肠上皮细胞后DLG5基因极显著上调表达；孙丽等[36]研究发现，猪miR-192可以靶向DLG5，在断奶仔猪抵抗F18大肠埃希菌感染过程中发挥作用。通过以上研究，我们可以初步判断这些关键靶基因可能在仔猪感染C型产气荚膜梭菌过程中起着重要调控作用，其次我们推测，沉默miR-204，可以有效抵抗C型产气荚膜梭菌感染引起的仔猪腹泻。

本研究初步筛选的重要靶基因还需要通过双荧光素酶报告基因试验和Western Blot实验进一步验证其靶向关系，miR-204及其靶基因能否作为仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染有效的分子标记，还需要通过一些细胞功能试验进行逐一验证。

4 结论

本研究成功建立了miR-204组织表达谱，其主要在7日龄仔猪肾脏、肝脏、胸腺、淋巴、十二指肠和回肠组织中表达，其成熟体序列在脊椎动物间高度保守，提示可能发挥重要生物学功能。预测得到的114个共同靶基因，显著(P<0.05)富集在15个GO功能和13个信号通路。结合课题组前期高通量测序获得的差异表达mRNA，本研究通过qRT-PCR方法初步证实SIRT1、BCL2L2和DLG5基因可能是miR-204参与调控仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染的关键靶基因，其具体功能需要今后重点关注和进一步研究。