基于表型性状与简单重复序列标记的浙江省芋种质资源遗传多样性比较

洪 霞，赵永彬，屈为栋，陈银龙，邱莉萍，王娇阳

(台州市农业科学研究院，浙江 台州 317000)

芋，又称芋头、芋艿、毛芋，为天南星科芋属植物，起源于中国、印度、马来半岛等地，在全世界广泛栽培[1-2]。我国芋栽培利用已有2 000多年历史，芋的营养价值丰富，富含淀粉、多糖、氨基酸、维生素和多种矿物质，其球茎、花、叶柄等部位主要作为蔬菜用。另外，芋还可以作为药用，传统中医认为芋味辛甘，全株可入药，具有补益脾胃、破血解散等功效，现在医学则认为芋在降血糖、抗肿瘤中能起到一定作用，其丰富的黏多糖还能提高机体免疫力[3-5]。世界范围内，芋的消费量在蔬菜中排名14，在块根作物中排名第5，被国际植物资源研究所列为“不被注意的重要植物”[6-7]，但是芋作为重要的蔬菜兼粮用特色作物，在促进浙江省农业产业结构调整和农民增产增收中发挥着重要的作用。

芋主要分为魁芋、魁子兼用芋、多子芋和多头芋，是种质创新的重要基础[8]。浙江省芋资源丰富，地方品种众多，经济效益好，如奉化芋艿、仙居红香芋、黄岩沙埠芋等在省内外具有一定知名度，是当地农民重要的经济来源[9-10]。浙江省栽培的芋品种主要为地方品种，一般经过无性繁殖进行保种种植，也有通过优良变异单株进行选育，如多子芋新品种金华红芽芋[11]。在缙云、永康等地，农技人员总结出适宜当地的高效栽培技术，促进当地的芋产业发展[12-13]。浙江省高度重视芋种质资源保护工作，在种质资源收集方面居于全国领先地位，但其遗传多样性分析相关的研究仍为空白，同名异种与异名同种现象并存，阻碍了芋资源评价、保护与利用创新。

形态学性状和DNA分子标记是研究芋遗传多样性和品种分类的主要方法。目前，形态学性状仍是种质资源研究的重要手段之一，在茶树、棉花等遗传多样性分析上均有较好应用[14-16]。近年来DNA分子标记开始应用到芋种质资源遗传多样性分析。沈镝等[17]利用随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记将云南的28份芋资源分成2个类群，一类为叶柄或芋梗食用芋，另一类多为子芋、母芋食用芋。利用武汉国家芋资源种质资源圃的芋种质，董红霞等[18]使用简单重复序列区间(ISSR)分子标记将72份芋资源在相似系数0.725处分为3大类，第一类有30份资源，主要为白芽绿柄多子芋；第二类共22份资源，红紫柄多子芋最多，为9份；第三类20份资源中淡红芽乌绿柄多子芋较多，为7份。此外，You等[19]还利用转录组测序方法开发了新的芋资源表达序列标签-微卫星(EST-SSR)标记，丰富了芋的简单重复序列(SSR)标记。在不同的分子标记应用中，SSR标记的稳定性、重复性较好，在全基因组中分布广泛，也是农业农村部用于种质纯度鉴定的分子标记[20]。本研究选取25份浙江省地方特色芋种资源，依据芋种质资源描述规范考察生物学性状，对15个表型性状进行遗传多样性分析、主成分分析，并开展形态性状标记和SSR分子标记相结合的聚类分析，旨在揭示地方品种之间的亲缘关系，挖掘特异芋种质，为芋种质利用创新提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取的25份特色芋种质材料来源于浙江省芋种质资源圃，主要从浙江省各个市县区的乡镇、村等收集而来，为不同的地方芋[C.esculenta(L.) Schott]品种，详见表1。试验所用的20条SSR引物从已经发表的芋89对SSR引物筛选得到，引物由北京鼎国生物科技公司合成[19，21-22]。dNTPs、Easytaq®DNA polymerase for PAGE等试剂均来自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司。用于丙烯酰胺凝胶电泳的AgNO3、NaOH等试剂均购自北京鼎国生物科技公司。

表1 二十五份供试浙江芋种质资源Table 1 25 taro germplasms from Zhejiang Province

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计与性状观测

材料均种植于浙江省芋种质资源圃，位于台州市农业科学研究院临海试验基地(121°14′ E， 28°83′ N)，2017—2018年连续2年试验，完全随机设计，株距35 cm，行距65 cm，每份资源种植20株。在生长中期(7—8月份)，每个品种资源随机选择5个植株调查地上部叶片、叶柄等各项性状；在收获期(10月)观测地下部的子孙芋、母芋的性状，并测定子孙芋总质量与母芋质量。所有性状观测按照芋种质资源描述规范与数据标准进行[23]，其中表型性状各项指标与赋值见表2。

续表1 Continued Table 1

表2 表型性状指标与赋值标准Table 2 Morphological traits and assignment criterion

1.2.2 DNA提取

取芋幼嫩叶片，使用CTAB法提取全基因组DNA，1%琼脂糖凝胶鉴定DNA的纯度，使用Nanodrop测定核酸浓度，用灭菌去离子水将DNA稀释至50 ng·μL-1，-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增与SSR检测

SSR-PCR总反应体系为15 μL，其中10 × PCR buffer for page 1.5 μL、0.2 mmoL·L-1dNTPs 2 μL、0.5 μmoL·L-1的正反引物各0.5 μL、DNA 模板1 μL、1 UTaqDNA聚合酶0.2 μL。SSR扩增在ABI Veriti PCR扩增仪上进行。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55～58 ℃(每对引物的最适退火温度)退火30 s，72 ℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。SSR扩增产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳装置为北京六一生物科技有限公司DYCZ-30C型，通过银染、显色并拍照。

1.3 数据统计与分析

对表型性状的观测进行数量化赋值(表3)，接着进行统计分析，计算遗传多样性指数，以Shannon Wiener指数H′表示。H′=-∑(Pi)(lnPi)，其中Pi为第i种样品在群体中的频率。通过计算子孙芋总质量与母芋质量的比值，将芋资源分为魁芋(小于1)、魁子兼用芋(等于1)、多子芋(大于1)等类型。采用SPSS 20.0对表型性状进行主成分分析，使用NTSYS-pc Ver. 2. 10软件进行聚类，函数选用EUCLID。

每个SSR位点条带清晰且在电泳迁移同一位置重复出现的记作1，没有条带记作0，条带不确定的记为2，构建excel 0、1矩阵。统计每个SSR引物的等位变异位点数和总等位变异位点数，计算多态信息含量PIC(polymorphism information content)值。将数据矩阵导入NTSYS-pc Ver. 2. 10软件进行分析，先用DICE方法计算遗传相似系数(genetic similarity，GS)，接着使用SHAN程序按照非加权配对法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 芋种质资源表型性状多样性

芋的叶形、叶柄颜色、母芋的芽色、子孙芋质量占比等一直是芋园艺学分类的重要依据。如表3所示，芋表型性状的变异系数为0～56.98%，平均为31.32%。其中，母芋表皮颜色变异系数最大，为56.98%；其次为母芋的芽色与叶心色斑颜色，分别为55.56%与47.79%(表3)。在25份芋资源中，母芋肉颜色是没有变异的，全部为白色。15个性状的遗传多样性指数为0～1.95，多样性指数均值为0.97，其中叶柄中下部颜色的遗传多样性指数最大，为1.95，其次是母芋芽色和子芋形状，分别为1.54和1.38，随后分别是叶心色斑类型和叶形。芋收获后，子孙芋总质量与母芋质量的比值变异范围为0.82～3.96，25份芋资源中，魁芋4份，魁子兼用芋1份，多子芋为20份(表1)。

表3 表型性状统计分析与多样性指数Table 3 Statistic analysis and diversity index of phenotype

2.2 芋种质资源的表型性状主成分分析

对25种芋资源具有不同程度变异的14个表型性状进行主成分分析，结果表明，前5个主成分对总变异的累计贡献率总计达77.649%，特征值总和为10.871，可反映大部分表型指标(表4)。其中，主成分1特征值为3.618，贡献率为25.846%，特征向量值比较高且为正值的有子芋形状、孙芋形状、叶尖、叶形、叶基，分别为0.487、0.419、0.335、0.310、0.209，这些形状变异指标可反映多子芋品种形状综合因子。特征向量值为负值的农艺性状有母芋表皮颜色、母芋芽色与母芋形状，说明在多子芋品种选育中母芋性状具有一定的选择性。主成分2特征值为2.777，贡献率为19.833%，主要体现母芋芽色、叶心色斑类型、叶形、叶心色斑颜色、叶尖、叶基等变异，反映叶片形状综合因子。主成分3特征值1.869，贡献率为13.349%，主要反映叶心色斑颜色、母芋形状、母芋肉纤维颜色、叶柄中下部颜色的变异，这4个形态标记的特征向量均为正值，为0.384～0.486，主要反映母芋株型性状因子。主成分4的特征值为1.522，贡献率为10.874%，以母芋表皮棕毛类型特征向量最大，为0.650。主成分5的特征值为1.085，贡献率为7.747%，主要表征母芋表皮颜色、叶形、母芋芽色、母芋肉纤维颜色等的变异。

表4 各表型5个主成分的特征向量与贡献率Table 4 Egienvalue and contribution rate of the 5 principal component factors of each phenotype

2.3 芋种质资源表型性状的聚类分析结果

EUCLID聚类结果显示，在遗传距离4.171处可以将25份芋资源分成5个类别(图1)。第Ⅰ类包括了6份资源，其中有1份魁芋，5份多子芋；叶为箭形或卵形，叶心无色斑或为扩展状；除7号车梢芋叶柄中下部颜色为深绿，其余均为绿色；在母芋芽色方面，10号丽水芋头为紫红芽，其余为淡红芽；子孙芋的形状以棒槌形与长卵形为主，母芋形状主要为圆柱形。第Ⅱ类仅有3号香蕉芋，为深绿柄白芽魁芋。第Ⅲ类由2份紫红柄魁芋(1份白芽，1份黄白芽)与4份紫黑柄多子芋(1份黄白芽，3份白芽)组成；叶形为箭形或卵形，叶尖多钝，叶心无色斑或为斑点，以紫红色为主；子孙芋形状全为卵圆形，母芋形状为圆柱形，芽色偏白。第Ⅳ类有10份资源，16号为魁子兼用芋，其余9份为多子芋；叶柄中下部为绿色，深绿色或乌绿色；子孙芋形状为倒圆锥或卵圆，母芋形状为圆球形或圆柱形；芽色有白芽(7份)、黄白芽(1份)或淡红芽(2份)。第Ⅴ类为5号乌紫芋与22号土紫芋，它们均为紫黑柄多子芋，子孙芋形状卵圆，母芋芽白，呈圆柱形。

2.4 芋种质资源的SSR分子标记聚类分析结果

从已经发表的89对引物中筛选获得20对条带清晰，多态性高的SSR引物[19，21-22]。20对引物在25份芋资源中扩增共获得53个条带，平均每个引物扩增的位点数为2.65个。具有多态性的条带有48条，平均多态性比率为90.6%，PIC值为0.22～0.64，表明芋种质资源具有较高的遗传多样性。图2为SSR引物CE11在25份芋资源中的扩增图，扩增条带为100～200 bp。

通过NTSYS-pc Ver. 2.10软件对不同芋种质资源进行分子标记聚类分析，结果显示，DICE遗传相似系数平均值为0.665。其中，6号宁波白芋与12号衢州芋艿的相似系数最大，通过SSR标记未能区分这2份资源；相似系数最小的是11号宁波红芋(多子芋)与24号金华水芋(魁芋)，为0.357。在遗传相似系数0.721处，25份芋可以分为5个类别。第Ⅰ类为1号仙居红芋与10号丽水芋头，位于表型性状聚类的第Ⅰ类。第Ⅱ类有7份资源，在表型性状聚类的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类别中均有分布，由3份魁芋(2份白芽，1份淡红芽)，1份魁子兼用芋(白芽)和3份多子芋(淡红芽)组成。第Ⅲ类由7号宁波车梢芋(淡红芽)与24号金华水芋(黄白芽)组成，分别处于表型性状聚类的第Ⅰ类与第Ⅲ类。第Ⅳ类别共有9份多子芋(6份白芽，2份黄白芽，1份淡红芽)，包含了表型分类第Ⅴ类别的2份资源，其余7份在表型性状聚类的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ类中均有分布，其中位于表型性状聚类的Ⅲ类中有4份，Ⅳ类中2份。第Ⅴ类别共有5份多子芋(白芽)，被包含在表型性状聚类的第Ⅳ类中。由此可以看出，SSR分子标记的聚类结果与表型标记的聚类结果有一定的联系，却又有所不同。

编号1～25同表1。下同。No. 1-25 were the same as Table 1.The same as below.图1 基于表型的芋种质资源聚类分析结果Fig.1 Clustered results of Colocasia esculenta germplasm based on their phenotype

M，100 bp ladder Ⅰ(鼎国)。M， 100 bp ladder Ⅰ(Dingguo).图2 SSR引物CE11在25个芋资源中的扩增结果Fig.2 Amplification of SSR primer CE11 in 25 taro germplasms

图3 基于SSR分子标记的芋种质资源聚类Fig.3 Clustered results of Colocasia esculenta germplasms based on SSR Markers

3 结论与讨论

3.1 芋种质资源表型性状的遗传多样性

芋生物学性状的变异能够反映这个群体的遗传多样性，体现资源的丰富程度，是种质资源分类鉴定的依据之一。前人研究芋表型性状之间的联系，如多子芋叶柄颜色、芽色、芋形状之间的关系，但特定群体表型遗传多样性相关的统计分析未见相关报道[24]。本研究基于浙江省地方特色种质群体的表型性状分析，得到变异系数与多样性指数均值分别为31.32%与0.97。15个表型性状中，除了母芋肉颜色为稳定遗传，其余14个性状均出现不同程度的变异。在20份多子芋中，14份子孙芋形状为卵圆形，占比较高，说明生产中地方种植的这种类型品种较多，这可能与其商品性好密切相关，卵圆形性状也可作为优异芋种质判定指标之一，这与黄新芳等[25]的研究结果相一致。25份资源中，挖掘出2份特异芋种质，分别为9号台州黄岩水芋(白芽)与24号金华浦江水芋(黄白芽)，它们均为魁芋，叶柄中下部为紫红色。

通过对25份不同来源的芋种质资源进行主成分分析，结果显示，前5个主成分反映了14个性状的全部信息，累计贡献率为77.649%，累积特征值为10.871，反映了芋种质的大部分特征，并且不同主成分反映的表型性状差异较大。贡献率较大的指标为子孙芋形状、母芋芽色、叶心色斑颜色、叶柄中下部颜色、母芋表皮棕毛等，这些是造成芋种质表型差异的主要指标，可作为芋资源的鉴别指标。另外，品种资源和性状指标的选择相关联，多子芋型品种选育应注重第一主成分选择，母芋型品种则注重第三成分的选择。上述研究表明，浙江省地方芋品种群体资源的变异较为丰富。

3.2 表型性状聚类与SSR分子标记聚类的比较

为揭示不同芋资源之间的亲缘关系，本研究分别采取了表型性状与SSR分子标记对25份浙江省芋种质资源进行聚类分析。试验结果显示，分子标记聚类的Ⅰ类包含于表型性状聚类的Ⅰ类之中，而表型性状聚类的Ⅰ类还包含了分子标记聚类Ⅱ类的4号与20号资源，Ⅲ类中的7号资源与Ⅳ类中的8号资源；表型性状聚类的第Ⅱ类位于分子标记的Ⅱ类中，第Ⅲ类中有4份位于分子标记聚类的Ⅳ类中，另外2份分别位于Ⅱ类与Ⅲ类；表型性状聚类的第Ⅳ类包含了分子标记聚类第Ⅴ类所有资源，以及第Ⅱ类中3份资源与第Ⅳ类中的2份资源；分子标记聚类的第Ⅳ类还包含了表型性状聚类的第Ⅴ类资源。由此可见，表型性状聚类与分子标记聚类两者具有一定的联系，但又有所不同。赵文杰等[26]在甜高粱的聚类分析中也获得了类似结论。这可能是由于两者聚类的理论基础不一样，SSR标记是基于芋的基因序列的差异，而表型标记是基因跟环境共同作用的结果。在本研究中，不论是表型性状聚类还是分子标记聚类，不同芋资源之间的亲缘关系与地理来源并没有明确关系，与前人的研究具有一致性[27]。如1号仙居红芋与10号丽水莲都芋头亲缘关系较近，但地理位置较远；而6号白芋与7号车梢芋都来自宁波高堂岛乡，但亲缘关系较远。

在芋种质资源的遗传多样性方面，国内已有研究基于云南、四川、国家武汉芋种质资源圃等的芋资源，RAPD、ISSR、SSR、SRAP等分子标记聚类分析均有报道[17-19，27-29]。浙江省芋种植范围广，地方品种众多，全省各县市区均有分布，是重要的蔬菜兼粮用作物，这些地方品种之间的亲缘关系首次得到深入分析。通过表型性状聚类与分子标记聚类的比较，在表型性状聚类中可以看到第Ⅲ类别中15号、18号、23号这3份资源未能区分，而使用SSR分子标记则能较好地将其分开；在SSR分子标记聚类中，6号与12号相似系数达1，通过表型性状聚类则能很好地鉴别。本研究基于浙江省特色地方芋小种进行表型性状与分子标记2种方式的聚类，在芋资源遗传多样性研究中属首次，更好揭示了芋资源地方小种的亲缘关系，也直观地表明了生物学性状与分子标记在种质资源的鉴别方面具有很好的互补作用。此外，本研究还挖掘出2份特异芋种质，表明浙江省芋种质资源丰富的遗传多样性，这将为芋种质资源的进一步保护、利用与创新提供重要的理论依据。