缺血性中风瘀毒互结证病证结合动物模型研究

2020-10-14蒋成婷葛金文聂慧芳罗宁钟达源邓奕辉

中国中医药信息杂志 2020年9期

蒋成婷，葛金文，聂慧芳，罗宁，钟达源，邓奕辉

蒋成婷，葛金文，聂慧芳，罗宁，钟达源，邓奕辉

湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙 410208

探索缺血性中风瘀毒互结证病证结合动物模型制备方法。通过肾上腺素/内毒素、角叉菜胶（CA）和角叉菜胶/干酵母菌（CA/Y）3组药物干预，并复合大脑中动脉梗死（MCAO）构建缺血性中风瘀毒互结证大鼠模型。造模后24 h，观察并检测大鼠表征、神经功能评分、脑病理形态学、血液流变学和脑组织促炎因子水平。上述3组病证结合组大鼠缺血侧大脑皮质和海马均出现显著神经元坏死和免疫细胞浸润，且CA组和CA/Y组大鼠肢体远端肤色晦黯甚至发黑；其中，CA/Y组神经功能缺损症状和血液流变学改变最显著，低切、高切全血黏度均明显升高（＜0.05），且缺血侧脑区促炎因子白细胞介素-1β水平显著升高（＜0.01）。角叉菜胶和干酵母菌两种因素叠加复合MCAO手术造模能较好地构建缺血性中风瘀毒互结证动物模型。

缺血性中风；瘀毒互结；动物模型；病证结合

缺血性中风是一种因栓子或血栓阻塞脑部血流而导致的脑内局部缺血缺氧的中风类型，具有高发病率、高病死率和高致残率特点[1-2]。缺血性中风属中医学“中风”范畴，历代医家将其病因归结为“虚、风、火、痰、瘀、毒”[3-4]。目前，理论研究表明，瘀毒互结已成为缺血性中风的重要病机[5]。临床研究表明，中风后3～5 d患者出现明显毒损症状[6]，且利用化瘀解毒法能提高缺血性中风疗效[7-8]。课题组前期通过体内实验证实化瘀解毒法能改善大脑中动脉梗死（MCAO）大鼠神经功能缺损症状，且较单纯活血化瘀法或清热解毒法治疗效果更好[9-10]。瘀毒互结证是中风病主要证候之一，但鲜有文献阐明其临床机制。有效病证结合动物模型将有助探索中风病中医证候病理生理机制，进而为临床药物筛选提供靶点。在课题组前期研究基础上，本实验提出利用肾上腺素/内毒素（adrenaline/lipopolysaccharide，A/LPS）、角叉菜胶（carrageenan，CA）、角叉菜胶/干酵母菌（CA/Yeast，CA/Y）3种方法干预大鼠后进行MCAO造模构建中风瘀毒互结证病证结合模型，并对其表征、大脑病理形态学改变、血液流变学和脑内促炎因子水平等进行评价，旨在建立一种稳定且符合临床表现的中风瘀毒互结证病证结合模型。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量250～280 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SYXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心，实验动物环境设施合格证号SYXK（湘）2015-0003。

1.2 试剂

0.1%肾上腺素，远大医药中国有限公司；细菌脂多糖（LPS），美国Sigma公司，批号O111B4，用生理盐水配制成1 mg/mL，再用0.22 μm滤器除菌，置4 ℃冰箱贮存，使用时用生理盐水稀释成50 μg/mL；CA，上海麦克林生化科技有限公司，批号C804872，用生理盐水配制成10 mg/mL，用沸水浴使之充分溶解混匀，冷却后置于0～5 ℃冰箱保存备用。高活性Yeast，湖北安琪酵母股份有限公司，批号GB/T20886，用生理盐水配制成0.2 g/mL，现配现用；MCAO栓线（北京西浓科技有限公司，型号263650A4）；RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒（TIANGEN BIOTECH，批号010-59822688）；2×NovoScript®SYBR qPCR SuperMix Plus，cDNA purge，RNase Free Water（Novoprotein，批号E096）。白细胞介素-1β（IL-1β）引物，由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成，引物序列：上游5’-CAGGCTCCGAGATGAACAAC-3’，下游5’-GGTG GAGAGCTTTCAGCTCATA-3’。

1.3 仪器

KD-BM Ⅱ电脑生物组织包埋机（金华市科迪仪器设备有限公司），轮转式切片机（20000056）、MoticamPro显微镜（赛默飞世尔上海仪器有限公司，BA410E），T100TMThermal Cycler反转录仪（BIO-RAD公司），多功能酶标仪（BioTek），CFX96TMOptics Module荧光定量PCR仪（BIO-RAD公司），微量高速冷冻离心机（Thermo Scientific）。

1.4 分组和造模

大鼠适应性喂养7 d，按随机数字表法分为假手术组（J组）、MCAO组（IS组）、CA＋MCAO组（CA组）、CA/Y＋MCAO组（CA/Y组）和A/LPS＋MCAO组（A/LPS组），前4组各6只，A/LPS组12只。CA组大鼠腹腔注射CA 50 mg/kg，每日1次，连续3 d[11]。CA/Y组在CA组基础上，第4日大鼠背部皮下注射0.1%干酵母悬液10 mL/kg[12]。A/LPS组大鼠皮下注射0.01%肾上腺素溶液0.8 mg/kg，每日1次，连续14 d，第15日大鼠尾静脉注射50 μg/mL LPS溶液（50 μg/kg）[13-14]。IS组经药物干预后24 h的CA组、CA/Y组和A/LPS组采用改良Zea Longa线栓法制备大脑MCAO永久性脑缺血模型[15]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，仰卧位固定于鼠板，通过腹侧颈切口分离出右颈总动脉，于分离出的颈总动脉处剪一小口，从此处将栓线插入颈内动脉，并前进以闭塞大脑中动脉。以线栓插入大脑中动脉即刻作为0时。假手术组大鼠除未插入栓线外，接受MCAO造模相同的外科手术过程。

1.5 神经功能评分

大鼠MCAO造模后24 h评估神经功能缺损，神经功能评分方法参考Zea Longa评分标准[15]。0分：无神经功能缺损；1分：轻度局灶性神经功能缺损（不能完全伸展左前爪）；2分：中度局灶性神经功能缺损（向左转圈）；3分：严重神经功能缺损（向左侧倾倒）；4分：不能自发行走且意识水平低下。

1.6 表征采集

造模完成后24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，采用数码相机对大鼠耳廓、四肢、尾部进行图像采集。

1.7 脑组织病理形态学检测

HE染色观察脑组织变化，包括大脑皮质、海马和纹状体形态。大鼠腹主动脉采血，取全脑固定于4%多聚甲醛溶液24 h，包埋石蜡，切成4 μm厚冠状切片，然后用二甲苯和乙醇脱蜡。切片HE染色，光镜下观察组织形态学变化。

1.8 血液流变学检测

大鼠表征采集后，于腹主动脉采血，用血液流变仪检测全血黏度和纤维蛋白原指标。

1.9 荧光定量PCR检测白细胞介素-1β基因表达

总RNA通过RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒提取，总cDNA用2×NovoScript®SYBR qPCR SuperMix Plus提取。将提取的cDNA进行扩增，取新200 μL无酶离心管，加10 μL 2×NovoScript®SYBR qPCR SuperMix Plus、IL-1β上游引物和下游引物各1 μL模板cDNA和7 μL RNase-Free ddH2O，荧光定量PCR仪中扩增，反应体系为95 ℃、1 min，再95 ℃、20 s和60 ℃、1 min（40个循环）。反应后得Ct值，计算ΔΔCt值。ΔCt＝Ct目的基因－Ct内参，ΔΔCt＝ΔCt实验－ΔCt对照，基因相对表达量用2-ΔΔCt表示。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠表征比较

CA组和CA/Y组在CA注射后第2日即出现尾部远心端瘀血，造模完成后24 h尾部远心端及四肢末梢出现皮肤发黑，且局部发黑处皮肤温度降低。A/LPS组、IS组和J组表征无明显变化，见图1。由此看出，CA组和CA/Y组大鼠表现更符合瘀毒互结证病情急重、肤色晦黯的特征。

注：A. CA组；B. CA/Y组；C.A/LPS组；D. IS组；E. J组；F. CA注射0日；G. CA注射1 d；H. CA连续注射3 d

2.2 各组大鼠神经功能评分比较

造模后24 h对大鼠进行神经功能评分，J组大鼠未见明显神经功能缺损症状，病证结合组（A/LPS组、CA组和CA/Y组）和单纯病组（IS组）大鼠具有较明显神经功能缺损症状，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；与IS组比较，病证结合组大鼠神经功能缺损症状差异无统计学意义（＞0.05），见图2。由此得出，CA/Y组神经功能缺损最严重，在宏观表征上更符合瘀毒互结证发病急且病情严重特点。

注：与J组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 各组大鼠脑组织病理形态学改变比较

造模后24 h大鼠进行大脑病理形态学检测。J组大脑皮质、海马和纹状体区未见明显病理形态学改变；病证结合组（A/LPS组、CA组和CA/Y组）和IS组大鼠脑组织出现明显损伤，HE染色显示缺血侧大脑皮质和海马形态明显被破坏，出现大量神经元坏死，胶质细胞增多，免疫细胞浸润，而纹状体区破坏较轻微；病证结合组大鼠脑组织形态破坏较单纯病组严重，见图3。由此可得出病证结合组均能造成明显神经元坏死和免疫细胞浸润，在细胞形态学上符合瘀毒互结证急且重的特点。

图3 各组大鼠脑组织皮质、海马和纹状体形态（HE染色，×200）

2.4 各组大鼠全血黏度比较

造模后24 h检测大鼠全血进行血液流变学。另外，考虑到A/LPS组大鼠造模周期较长并为减少双重药物干预时实验误差，故将该组大鼠分配12只，其余4组每组6只。在实验中，上述5组手术中共死亡5只，A/LPS组药物干预时死亡1只，CA组因血液凝固弃用标本1个。结果显示，在不同切变率（1、5、30、200 s-1）时，病证结合组（A/LPS组、CA组和CA/Y组）和IS组大鼠全血黏度均升高；与J组比较，IS组全血黏度低切（1、5 s-1）、中切（30 s-1）和高切（200 s-1）时均显著升高（＜0.01），且CA/Y组全血黏度低切（1、5 s-1）和高切（200 s-1）时明显升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与IS组比较，病证结合组大鼠全血黏度均降低，A/LPS组全血黏度（切变率为1、5、200 s-1时）和CA组全血黏度（切变率为1、5 s-1时）明显降低，差异有统计学意义（＜0.01，＜0.05），见表1。由此得出在全血黏度层面，CA/Y组更符合瘀毒互结证血液流动缓慢、瘀滞的特点。

表1 各组大鼠全血黏度比较（±s，mPa•s）

注：与J组比较，*＜0.05，**＜0.01；与IS组比较，#＜0.05，##＜0.01

2.5 各组大鼠纤维蛋白原比较

造模后24 h检测大鼠全血纤维蛋白原，每组检测大鼠数量同“2.4”项。与J组比较，IS组大鼠纤维蛋白原含量明显降低（＜0.01），病证结合组大鼠纤维蛋白原含量降低，差异无统计学意义（＞0.05）；与IS组比较，A/LPS组大鼠纤维蛋白原含量明显升高（＜0.01），见图4。由此得出MCAO手术造模能造成大鼠低凝状态，而病证结合组药物可不同程度影响大鼠纤维蛋白原水平从而改变低凝状态。

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与IS组比较，##P＜0.01

2.6 各组大鼠缺血侧大脑组织促炎因子白细胞介素- 1β基因表达比较

上述数据表明，CA/Y组能较好地模拟缺血性中风瘀毒互结证病证结合动物模型。基于以上结果，对CA/Y组检测大鼠缺血侧脑内促炎因子IL-1β信使RNA基因表达。与J组比较，CA/Y组和IS组大鼠脑组织IL-1β mRNA表达明显升高（＜0.01）；与IS组比较，CA/Y组大鼠脑组织IL-1β mRNA表达明显降低（＜0.01），见图5。由此得出CA/Y组导致脑内毒性产物IL-1β显著增高，进一步证明CA/Y组缺血性中风瘀毒互结证模型成功。

注：与J组比较，**P＜0.01；与IS组比较，##P＜0.01

3 讨论

从中医视角，中风病除风证、火热证、痰湿证、血瘀证、气虚证和阴虚阳亢证外，瘀毒互结证也是重要证候[5]。理论研究表明，瘀毒作为致病因素，既是引发缺血性中风发作的关键之“因”，又是瘀血日久不化转化为毒所致的“果”[5，16]。瘀毒互结，阻滞脑窍，导致气血运行失常，引动内风而发中风，此为“因”。瘀毒阻滞三焦，气机升降受阻，浊阴不降，则浊毒不能随水液代谢排出体外，毒邪积聚日久化热，煎灼精血津液，导致血液黏稠而致瘀血加重，进一步加重脑窍阻塞；而气机升降失常，清阳不升，则会加重脑窍缺血缺氧，毒、瘀相互转化并结合为病，以上恶性循环导致中风病情进一步加重，此为“果”。临床研究也表明，瘀毒是中风病情恶化的关键病机，中风后3～5 d患者体温、血压和症状出现明显加重表现[6]，而利用化瘀解毒法治疗缺血性中风能显著改善中风后神经功能缺损症状[7-8]。综上可知，瘀毒互结是导致中风病情恶化及不良功能预后的一种重要病机[17]。因此，构建合适的病证结合动物模型，对研究者理解中风瘀毒互结发病机制及新药开发提供靶点具有重要意义。

事实上，瘀毒互结和炎症反应密切关联，且均是导致中风病情加重的重要原因[17-18]。理论研究表明，瘀毒阻塞脉络，气血运行不畅，使毛细血管通透性增强，促进炎症渗出、充血和水肿[17]，呈现为以微血管为核心的炎症级联损伤病理过程[18]，而这些病理过程是加重中风后脑损伤的重要原因[19]。临床研究表明，中风瘀毒互结证患者血液中大多炎症因子水平明显升高，且这些因子与神经功能缺损呈正相关[20-21]。有研究显示，中风瘀毒互结证患者急性期血液中炎性因子高敏C反应蛋白（Hs-CRP）、IL-6升高。同时，这些因子与神经功能缺损程度呈正相关[20]。张粲等[21]通过临床观察发现，中风瘀毒互结证患者血清中白细胞、Hs-CRP和红细胞沉降率明显升高，而运用解毒化瘀汤干预后能明显降低上述炎症指标、改善患者中风后神经功能缺损症状。可见，体内炎症因子升高是中风瘀毒互结证患者的微观表现。研究表明，肾上腺素、内毒素、角叉菜胶和干酵母菌单用或复合使用均能够诱发体内炎症因子升高[22-23]。在此基础上，本实验参考中医瘀热证和火毒证造模方法[11-14]，利用导致炎症反应药物，即A/LPS、CA/Y和CA并复合MCAO手术造模方法构建缺血性中风瘀毒互结证模型。

在临床实践中发现瘀毒具有酷烈、暴戾和多损的特点，其致病急且重，患者血液流变学呈现高黏状态[7，25]。本实验通过观察表征、病理形态学改变和血液流变学变化来评估中风瘀毒互结证模型。表征观察是中医望诊的体现，而望诊在中医辨证论治中至关重要。《素问•五脏生成篇》“色见青如草兹者死，黄如枳实者死，黑如炲者死，赤如血者死，白如枯骨者死”，总结了色泽与病情严重程度和预后的关系。本研究中CA/Y组和CA组大鼠均出现肢体远端部分瘀血或发黑，依据“黑如炲者死”，提示病情严重、预后不良，符合瘀毒酷烈、暴戾和多损的特点[5，24]。而病理形态学改变能从细胞形态学变化直观地判别病情严重程度。本实验病理形态学检测提示CA/Y组和CA组大鼠脑内神经元坏死明显增多且有免疫细胞浸润，从细胞形态学角度也符合瘀毒致病严重的特点。瘀毒胶结阻滞血脉会导致血液黏滞且流动缓慢，而血液流变学能够反映血液流速以及黏稠度，临床可作为评价瘀毒互结的重要指标[25]。本实验通过检测血液流变学发现，CA/Y组大鼠全血黏度在低切变率（1、5 s-1）和高切变率（200 s-1）时均明显升高，呈高黏状态。全血黏度在低切变率（1、5 s-1）时，血液易形成红细胞聚集体，低切值升高，说明红细胞聚集程度增高，血液变黏稠且血流缓慢。全血黏度在高切变率（200 s-1）时反映红细胞变形程度，高切值升高说明红细胞变形性差，血流阻力增大[25]。CA/Y组低切值和高切值均升高，说明全血黏度增高，血液流动变慢，易形成血栓，符合瘀毒互结证血液流动变化的特点。对CA/Y组大鼠病证结合模型进行进一步的实验论证，发现该组缺血侧脑区毒性产物促炎因子IL-1β mRNA表达明显升高，进一步证明CA/Y组缺血性中风瘀毒互结模型成功。而CA/Y组IL-1β较IS组降低，结合病理形态学改变，表明CA/Y组细胞坏死更明显，这些坏死细胞可能包括分泌IL-1β的细胞，因此IL-1β升高在CA/Y组较IS组低，进一步表明瘀毒损害暴戾、严重的特点。需要说明的是，本实验中单纯病组纤维蛋白原明显降低，说明在手术过程中消耗大量纤维蛋白原，术后大鼠处于低凝状态，而3组病证结合组大鼠纤维蛋白原虽有降低，但差异无统计学意义，且A/LPS组比单纯病组纤维蛋白原明显升高，说明前期药物干预可能导致大鼠纤维蛋白原合成增多，血液处于高凝状态，在一定程度上抵消了手术的消耗。

综上所述，我们发现利用药物A/LPS、CA/Y和CA并复合MCAO手术造模能模拟出缺血性中风瘀毒互结证模型，且角叉菜胶和干酵母菌2种因素叠加组在表征、脑病理形态学变化、血液流变学和炎症因子变化上均符合中风瘀毒互结的特征，其表现更加典型且稳定，可用于缺血性中风瘀毒互结证的中医基础理论研究、新药开发和中药药效靶点筛选等多方面的研究。

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Study on Disease-syndrome Combination Animal Model of Ischemic Stroke Stasis Toxin Syndrome

JIANG Chengting, GE Jinwen, NIE Huifang, LUO Ning, ZHONG Dayuan, DENG Yihui

To explore the method for establishing the disease-syndrome combination animal model of the ischemic stroke stasis toxin syndrome.The rat model of the ischemic stroke stasis toxin syndrome was established by the treatment of drugs and the surgical method of middle cerebral artery occlusion (MCAO). These drugs were devided into 3 groups, i.e., adrenaline + endotoxin, carrageenan (CA) and carrageenan + yeast (CA/Y). After that, the surgical model of MCAO was conducted. 24 hours after MCAO, the changes of skin color, neurological function scores, brain cell morphology, hemorheology, and proinflammatory factors in the ischemic area were detected.Neuronal necrosis and immune cells were observed in the ischemic cortex and hippocampus of disease-syndrome combination rats. Additionally, dark and gloomy skin was observed in the rat of CA and CA/Y groups. Furthermore, the change of neurological deficits and hemorheology were significant in the CA/Y group, whole blood viscosity increased significantly at low and high shear rates (<0.05). Additionally, the gene expression of IL-1β was significantly increased in the ischemic brain of the CA/Y group.The disease-syndrome combination animal model of ischemic stroke stasis toxin syndrom can be established by the combination of carrageenan, yeast and the surgical approach of MCAO.

ischemic stroke; stasis toxin syndrome; animal model; disease-syndrome combination