小分子代谢物在肺癌和肺炎鉴别诊断中的潜在作用

邹 琛 ，徐润灏 ，张 泓，马 展，陈 黎，张 洁，李 敏，张舒林

1. 上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系，上海200025; 2. 上海交通大学附属儿童医院检验科，上海200062；3.上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，也是恶性肿瘤死因的首位[1]。早期诊断和及时治疗是提高肺癌患者生存率的关键。随着医学影像学技术的发展，肺癌误诊率及漏诊率大幅降低，但影像学检查仍然有假阳性率高、过度诊断、辐射剂量超标等不足[2]。代谢组学是20 世纪末发展建立的一门学科，其研究对象大都是相对分子质量小于1 000 的小分子物质。体内代谢改变广泛存在于肿瘤细胞与正常细胞间，以满足肿瘤自身恶性增殖、侵袭、转移和免疫逃逸的需要[3]。已有研究[4-6]证明，血清醛、酮、醇、氨基酸等人体代谢产物在肺癌患者和健康人群中有着显著差异，但有关其诊断效能的研究还较少。本研究通过应用代谢组学技术对肺癌和肺炎患者血清小分子代谢产物进行探索，建立、优化诊断模型，寻找快速高效的肺癌和肺炎鉴别诊断的新方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2018 年4—12 月于上海交通大学医学院附属仁济医院就诊的肺癌组患者95 例和肺炎组患者69 例，医院体检中心健康人群90 例为健康对照组。纳入标准：肺癌组患者均已通过组织病理学检查确诊，且未发现肝肠转移。肺炎组患者均已排除肺癌可能。肺癌组和肺炎组患者均未并发肝功能异常、肠道炎症、胆囊结石，且未服用免疫抑制剂及氨基酸类药物。健康对照组胃肠道功能未见异常，排除高血压、糖尿病、慢性肝胆疾病及肝肾功能异常。研究获得医院伦理委员会通过，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本前处理 采用含促凝剂的真空采血管，收集空腹静脉血4 mL，16 169×g 离心10 min，2h 内分离血清。在24 h 内进行检测的样本冷藏（2 ～8 ℃）保存，24 h 内无法测定的样本冷冻（-20 ℃及以下）保存。

1.2.2 氨基酸代谢谱检测 采用API3200MD 三重四级杆质谱仪（美国ABSciex 公司）、Shimadzu 系列液相色谱仪（日本岛津公司）检测。氨基酸代谢谱分析试剂盒（上海可力梅塔生物医药科技有限公司），可检测丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸。

分析样品处理：分离血清。取10 μL 待测样本于EP 管中，加入40 μL 氨基酸样本稀释液，震荡混匀（10.06×g，5 min）。50℃氮气吹干；加入复溶液100 µL 至96 孔板内，震荡混匀（0.81×g，5 min）。

分析方法：高效液相色谱- 串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。色谱条件：分析柱为ACE Excel3AQ（3.0 mm×100 mm；美国Waters 公司）；流动相A 为水，流动相B 为甲醇（HPLC 级，MERCK 公司）。梯度洗脱；总分析时间为13 min；流速为0.5 mL/min；进样量为8 μL。质谱条件：电喷雾离子源，负离子扫描，雾化气压力为40 psi，辅助加热器压力为60 psi，气帘气压力为20 psi，碰撞气压力为6 psi，离子源电压为-4 500V，离子源温度为600 ℃。MRM 扫描分析。

1.2.3 胆汁酸代谢谱检测 采用API3200MD 三重四级杆质谱仪（美国ABSciex 公司）、Shimadzu 系列液相色谱仪（日本岛津公司）检测。胆汁酸代谢谱分析试剂盒（上海可力梅塔生物医药科技有限公司），可检测胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸、牛磺熊脱氧胆酸。

分析样品处理：取血清样本100 μL，加入含内标的提取液500 μL，涡旋混匀（12.58×g，5 min）；离心（16 169×g，10 min）；取上清液400 μL 于96 孔板中，60 ℃氮气吹干；加入复溶液100 µL，将96 孔板放置在微孔板恒温振荡器中混匀（1.10×g，10 min），转移96 孔板中的复溶液到专用过滤板中，过滤板下放置新的96 孔板，将过滤板及96 孔板一起放置于多管架自动平衡离心机中进行过滤，离心（2 810×g，1 min），收集滤液，上机进样。

分析方法： LC-MS/MS。 色谱条件：分析柱为XbridgeC18（3.0 mm×50 mm，3.5 µm； 美国Waters 公司）；流动相A 为水，流动相B 为甲醇（HPLC 级，美国MERCK 公司）；梯度洗脱；总分析时间为13min；流速为0.5 mL/min；进样量为8 μL。质谱条件：电喷雾离子源，负离子扫描，雾化气压力为40 psi，辅助加热器压力为60 psi，气帘气压力为20 psi，碰撞气压力为6 psi，离子源电压为-4 500 V，离子源温度为600 ℃；MRM 扫描分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。采用K-S 检验对数据进行正态性分布检验；正态性分布的定量数据以x—±s表示，组间比较采用独立样本t 检验；非正态分布的定性数据以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验；采用逐步法二元Logistic 回归进行相关性分析；根据Logistic 回归结果，以训练样本建立初步诊断模型，并以考核样本对诊断模型加以验证，验证通过后将训练样本和考核样本合并，建立最终诊断模型；以诊断概率Y1为新变量，作ROC 曲线并分析模型诊断性能。P<0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

肺癌组95 例，其中男性63 例，女性32 例，年龄范围为34 ～83 岁；肺炎组69 例，其中男性38 例，女性31例，年龄范围为24 ～82 岁；对照组90 例，其中男性52例，女性38 例，年龄范围为41 ～81 岁。

2.1 3 组间血清氨基酸代谢谱的比较

3 组间血清氨基酸比较结果见表1。肺炎组血清丙氨酸、组氨酸、赖氨酸均显著降低（均P=0.000），苯丙氨酸显著增高（P=0.000）；肺癌组血清丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸均显著降低（P=0.003；P=0.000； P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000）， 瓜氨酸、鸟氨酸显著增高（P=0.009；P=0.000）。5 种氨基酸在肺炎组和肺癌组间差异有统计学意义，其中精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸在肺癌组中显著低于肺炎组（P=0.001；P=0.001；P=0.009；P=0.000），瓜氨酸在肺癌组中显著高于肺炎组（P=0.001）。

表1 3 组间血清氨基酸代谢谱比较（μmol/L）Tab 1 Comparison of amino acid metabolism spectrum among 3 groups (μmol/L)

2.2 3 组间血清胆汁酸代谢谱的比较

3 组间血清胆汁酸比较结果见表2。肺炎组血清脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸等7 种胆汁酸显著降低（P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.001），甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸2 种胆汁酸显著增高（P=0.003；P=0.003）；肺癌组血清脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸2 种胆汁酸显著降低（P=0.005；P=0.000），胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸4 种胆汁酸显著增高（P=0.004；P=0.005；P=0.001；P=0.008）。

胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸7 种胆汁酸在肺炎组和肺癌组间比较差异有显著统计学意义（P=0.000； P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.002）， 其在肺癌组中均显著高于肺炎组。

表2 3 组间血清胆汁酸代谢谱比较（μmol/L）Tab 2 Comparison of bile acid metabolism spectrum among 3 groups (μmol/L)

2.3 氨基酸代谢谱与胆汁酸代谢谱对肺炎和肺癌的诊断效能

对在肺炎组和肺癌组中差异有显著统计学意义的5种氨基酸和7 种胆汁酸进行ROC 曲线分析（表3），结果显示：脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、苯丙氨酸有一定的诊断价值（AUC ≥0.7），其余代谢产物的诊断价值一般（0.5 ≤AUC<0.7）。12 个代谢物中，脱氧胆酸的敏感度和特异度均较高，且Youden 指数最高，是鉴别诊断能力最强的单个指标。

表3 5 种氨基酸和7 种胆汁酸的诊断效能分析Tab 3 Analysis of diagnostic efficiency of 5 amino acids and 7 bile acids

2.4 多种代谢物联合运用建立诊断模型

2.4.1 建立初步诊断模型 随机抽取90.0%的样本，即62 例肺炎和85 例肺癌样本组成训练样本。将在肺炎组和肺癌组中差异有显著统计学意义的12 个代谢物（精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸）纳入逐步法二元Logistic 回归分析（表4）。结果显示瓜氨酸、苯丙氨酸、脱氧胆酸是鉴别诊断肺炎和肺癌的独立影响因素。据此建立初步诊断模型： Y0=1/ （1+e-logit（P0））， 其 中logit（P0）=0.039× 瓜 氨酸-0.021×苯丙氨酸+0.005×脱氧胆酸+0.692，e 是一个自然常数，经模型系数综合检验χ2=144.02，P<0.05；Hosmer-Lemeshow 检验χ2=4.52，P>0.05，显示模型拟合度良好。根据ROC 曲线得出，该模型诊断最佳临界值为0.55，此时氨基酸和胆汁酸联合诊断肺炎的诊断效能最大，诊断灵敏度为76.5%，特异度为79.0%，在训练样本中共诊断成功49 例肺炎和65 例肺癌样本，诊断符合率

77.6%。

表4 12 种代谢产物逐步法二元Logistic 回归分析结果Tab 4 Analysis result of 12 metabolites by stepwise binary Logistic regression

2.4.2 验证初步诊断模型 将剩余10.0%的样本，即7例肺炎和10 例肺癌样本组成考核样本，代入模型Y 进行验证，共诊断成功5 例肺炎和8 例肺癌样本，诊断符合率76.5%，与训练样本的诊断符合率基本相同。

2.4.3 建立最终诊断模型 将训练样本和考核样本合并后，再将上述12 个代谢物做逐步法二元Logistic 回归分析，结果仍显示瓜氨酸、苯丙氨酸、脱氧胆酸是鉴别诊断肺炎和肺癌的独立影响因素。建立最终诊断模型： Y1=1/ （1+e-logit（P1））其中logit（P1）=0.037×瓜氨酸-0.027× 苯丙氨酸+0.004×脱氧胆酸+1.449。

2.4.4 分析最终诊断模型的诊断性能 以最终诊断模型诊断概率Y1为新变量作ROC 曲线分析，结果见图1， 显示曲线下面积（AUCROC） 为0.829（95%CI 0.762 ～0.883），最佳临界值为0.55，此处诊断灵敏度为76.8%，特异度为79.7%，符合率为78.3%。

3 讨论

图1 诊断模型鉴别诊断肺癌和肺炎的ROC 曲线Fig 1 ROC of diagnostic model for differential diagnosis in lung cancer and pneumonia

原发性肺癌是最常见的恶性肿瘤，且其发病率有逐年增高的趋势，及时准确地诊断肺癌直接影响患者的预后。目前有研究[7-8]显示，影像学方法的肺癌误诊率仍超过50%，其中约有40%被误诊为肺炎。现阶段临床采用的常用肿瘤标志物多为大分子蛋白，往往无法有效区分肺癌和肺炎[9]。不断有研究[10-11]指出，小分子代谢物在诊断效能上更有优势。随着各种检测技术，尤其是质谱技术的发展，使得精确测量小分子代谢物成为可能。因此，利用质谱和代谢组学方法检测肺癌患者体内小分子代谢产物的差异，从而探索相关的生物标志物，在肺癌和肺炎鉴别诊断中具有重要的临床价值。本研究利用质谱分析技术，集中对氨基酸谱和胆汁酸谱2 种类型的代谢物进行分析，寻找肺炎和肺癌患者中这2 类代谢产物的差异。

研究共检测了11 种常见蛋白质氨基酸和2 种非蛋白质氨基酸，与对照组相比，肺炎组血清丙氨酸、组氨酸、赖氨酸显著降低，苯丙氨酸显著增高；肺癌组血清丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸均显著降低，瓜氨酸、鸟氨酸显著增高，其中肺癌组中降低者均为蛋白质氨基酸，与Miyamoto 等[12]的研究结果一致。有报道[13-14]认为这是由于肿瘤增殖过程中，蛋白质及氨基酸被大量消耗，也有学者在血浆氨基酸谱的研究[15]中得出不同的结论，这可能由于血浆受EDTA 抗凝剂影响导致其部分组分的丢失或改变[16]。肺癌不仅影响人体的呼吸系统和循环系统，还会引起人体能量代谢的改变，导致机体氨基酸表达异常。在肿瘤患者体内，氨基酸为肺部肿瘤细胞的生长提供能量并构建其生长所需的蛋白质，并为肿瘤细胞在体内的免疫逃逸机制提供相应的功能[17]。氨基酸还能参与肺部肿瘤细胞调控的各个信号通路，参与细胞能量代谢相关信号通路的形成，从而控制细胞的生长和增殖 周期[18-19]。

胆汁酸是在肝细胞中合成初级胆汁酸，排入胆道后进入肠腔产生次级胆汁酸，并由肝门静脉重吸收返回肝脏[20]。与氨基酸代谢相比，胆汁酸代谢常见于肝胆疾病和肠道疾病方面的研究，目前其与肺部疾病相关的报道很少。本研究对胆汁酸在肺炎和肺癌患者体内代谢的差异进行分析。肺炎组与对照组相比，血清脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸7 种次级胆汁酸显著降低，甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸2 种初级胆汁酸显著增高；肺癌组血清脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸2 种次级胆汁酸显著降低，胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸4 种初级胆汁酸显著增高。据文献[21]报道，在肺炎患者体内，胆汁酸受体能通过抑制NF-κB 通路的激活而达到抑制炎症的效果，脂多糖及某些促炎细胞因子也可诱导肺部胆汁酸受体下调，进入外周血的胆汁酸相应减少。在肺癌患者体内，肺组织内的胆汁酸受体能激活细胞周期蛋白-D1，促进肺部肿瘤的增长[22]，也能通过激活JAK2/STAT3 信号通路刺激肺部肿瘤细胞增殖[23]；随着肿瘤的发生，肺癌患者的肺组织胆汁酸受体增多，进入外周血的胆汁酸相 应增多。

在了解肺癌和肺炎患者血清中相关代谢产物的变化和特征后，本研究对95 例肺癌患者、69 例肺炎患者和90例健康对照人群血清氨基酸和胆汁酸进行了比较，对其鉴别诊断效能进行综合评估。12 种代谢物在肺炎组和肺癌组间差异有显著统计学意义，其中精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸4 种氨基酸在肺癌组中低于肺炎组，胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸7 种胆汁酸和瓜氨酸在肺癌组中高于肺炎组。单个代谢产物诊断效能最好的是脱氧胆酸，其灵敏度为78.2%，特异度为71.1%，ROC 曲线下面积达到了0.768。为了评价上述12 项代谢产物的联合诊断效能，我们将其纳入Logistic 回归方程并建立诊断模型，初步的模型及最终的模型均提示瓜氨酸、苯丙氨酸和脱氧胆酸是联合诊断的最优组合。联合诊断模型的ROC 曲线下面积为0.829，高于所有单项代谢产物，因此联合诊断能提高相关代谢产物对肺癌和肺炎的诊断效能。同时，对模型的验证也显示，训练样本和考核样本的诊断符合率基本相符，故该模型有一定的临床价值，可以和常用的肿瘤标志物并结合影像学技术对肺癌和肺炎进行鉴别诊断。

本研究评价了13 种氨基酸和15 种胆汁酸及其联合检测对于鉴别肺炎和肺癌的临床价值，发现小分子代谢物联合检测的诊断效能显著高于单项分析指标。同时，联合检测的诊断效能也高于目前临床常用的单项肺部肿瘤标志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神经元烯醇化酶（nueron enolase，NSE）、鳞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）等，且小分子代谢产物联合检测的灵敏度高于肺部肿瘤标志物联合检测的灵敏度，但特异性稍有不如[24]。如果将小分子代谢产物和肺部肿瘤标志物联合检测，可能得到高于这二者对于肺炎和肺癌的鉴别诊断效能。

由于本研究尚未将全部氨基酸以及脂肪酸类、类固醇类等代谢物纳入，因此本研究得出的诊断模型还需要进一步优化。随着代谢组学的迅速发展，其在肿瘤的早期诊断、发生机制的探索、个体化治疗方案的制定等方面将发挥重要作用。

参·考·文·献

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