经静脉注射的单链9 型腺相关病毒介导基因在星形胶质细胞表达

王晓丹，杨 钊，沈帆霞,

1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院北院，上海201801；2. 美国加州大学旧金山分校麻醉与围术期医学系脑血管研究中心，旧金山94110，美国

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是一种单链DNA 病毒，属于非致病的、辅助病毒依赖型的细小病毒家族成员。与其他病毒载体相比，AAV 具有免疫原性较低、能够感染分裂和非分裂细胞、介导目的基因在宿主体内长期表达等特点[1]。AAV 可作为中枢神经系统疾病研究和基因治疗理想的重组病毒载体。

AAV 载体有多种血清型，然而大多数血清型由于不能通过血脑屏障（brain blood barrier，BBB），仅能通过立体定向注射等方法将其直接注射至脑中。经静脉给药的9 型AAV（AAA serotype 9，AAV9）能有效通过新生小鼠和非人灵长类动物的BBB 而受到广泛的关注[2]。然而经静脉注射的AAV9 不仅介导基因在脑部表达，也可能在其他外周器官如肝脏和心脏表达。因此如何调控目的基因在病变部位表达已成为近年来基因治疗领域的研究热点之一。组织出现缺氧时，低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）与低氧反应元件（hypoxia-responsive element，HRE）相互作用，可以诱导一系列缺氧响应相关基因表达，如促红细胞生成素和血管内皮生长因子。因此在启动子区加入9 个拷贝HRE 作为调控元件的AAV 载体能控制目的基因在缺血、缺氧区表达[3]。

自身互补AAV9（self-complementary AAV9，scAAV9）能够介导目的基因在新生小鼠脑中稳定表达，但当目的基因的互补DNA（complementary DNA，cDNA）片段大于2.1 kb，则无法构建scAAV。因而，本研究用单链AAV9（single-stranded AAV9，ssAAV9） 构建载体，探讨通过静脉注射含9 个拷贝HRE 的ssAAV9（AAV9-H9LacZ）是否能有效控制目的基因LacZ [β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）编码基因]在成年小鼠脑缺血区表达，并研究其可转染的脑细胞类型，以期为脑血管病的基因治疗提供新的方法和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄CD-1 雄性小鼠购自美国Charles River 实验室，动物饲养和实验步骤均符合加州大学旧金山分校动物伦理委员会的要求。小鼠在清洁级动物房饲养，每笼5 只，温度控制在（25.0±1.0）℃。

1.2 AAV9-H9LacZ 构建和病毒包装

AAV9 载体购自Vector Biolabs（美国），其中含β-gal编码基因的启动子（pβgal）。载体以Sma Ⅰ和Hind Ⅲ 为酶切位点进行酶切，在2 个末端反向重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）之间插入LacZ cDNA 质粒，并将9 个拷贝HRE 作为启动子用来控制LacZ 基因表达[4]。AAV9-H9LacZ 病毒的包装采用三质粒共转染法（helperfree AAV 包装系统）。2 个辅助质粒（其中一个携带腺病毒的VA、E2A 和E4 区，另一个携带AAV 的Rep 和Cap基因）和AAV9-H9LacZ 质粒共转染HEK293 细胞，包装AAV 重组病毒载体。采用氯化铯梯度离心纯化病毒。通过DNA 斑点杂交分析确定病毒滴度[5]。

1.3 实验分组

取12 只小鼠，随机分为假手术组和脑缺血组，每组6 只。在远端大脑中动脉闭塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）模型建立1 d 和5 d 后处死。取小鼠新鲜脑组织提取蛋白用于Western blotting，并制备石蜡切片用于免疫组织化学染色。

另外取12 只小鼠，全部建立dMCAO 模型，随机分为对照组和AAV9-H9LacZ 组，每组6 只。dMCAO 模型建立后1 h 分别静脉注射生理盐水和AAV9-H9LacZ 病毒。模型建立5 d 后处死，取小鼠新鲜脑组织制备冰冻切片用于免疫荧光染色，取脑组织和肝脏组织用于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷酶（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal）染色。

1.4 dMCAO 模型建立

1.5%异氟烷吸入麻醉小鼠。手术显微镜下，在右侧眼眶和耳屏间切1 cm 切口。移除约2 mm2的头骨后，用电凝阻塞大脑中动脉。后将骨板、颞肌复位并缝合皮肤。在手术过程中用热毯将体温保持在（37.0±0.5）℃。用激光多普勒血流仪（Vasamedics 公司，美国）监测小鼠表面脑血流（surface cerebral blood flow，sCBF），如小鼠缺血核心区的sCBF 超过基线的15%则除外。

1.5 AAV9-H9LacZ 的静脉注射

AAV9-H9LacZ 组在小鼠dMCAO 模型建立后1 h，经颈静脉注射溶解在200 μL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）的AAV9-H9LacZ [1×1012GC，GC为基因组拷贝（genome copy）]。对照组经颈静脉注射等量的生理盐水。

1.6 Western blotting 检测

利用BCA（bicinchoninic acid）法测定蛋白浓度。蛋白经7%～12%梯度凝胶电泳后转膜，抗HIF-1α 抗体（1:500 稀释；Novus 公司，美国）室温孵育1 h，PBS清洗后，辣根过氧化物酶标记的抗体（1:2 000 稀释；Amersham 公司，美国）孵育。使用增强型化学发光反应试剂盒（Amersham 公司，美国），曝光，显影。用Image J 1.63 软件定量分析蛋白条带。

1.7 免疫组织化学染色

脑组织切片以抗HIF-1 抗体 （1:500 稀释；Chemicon 公司，美国）孵育60 min，PBS 洗涤，滴加生物素化的二抗，PBS 洗涤，3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染细胞核。

1.8 免疫荧光染色

dMCAO 模型建立5 d 后处死小鼠，脑组织迅速冷冻保存在－80℃。然后置恒冷冰冻切片机，由嘴侧向尾侧行序列冰冻切片，脑冠状切片厚20 μm。免疫荧光染色所需特异性抗体为血小板 - 内皮细胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）抗体（1:50 稀释；AbD Serotec 公司，英国）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（1:500 稀释；Sigma-Aldrich 公司，美国）、神经元特异核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗体（1:500 稀释；Chemicon 公司，美国）和β-gal 抗体（1:500 稀释；Abcam公司，美国）。样本在一抗溶液中孵育90 min，在二抗Alexa 594 抗小鼠IgG 和Alexa 488 抗兔IgG（1:500 稀释；Invitrogen 公司，美国）中孵育60 min 后，用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的防荧光淬灭封片剂（vectashield）封片。以PBS 代替一抗作阴性对照。用德国Leica DMLS 荧光显微镜采集图像，每张切片在脑梗死周边区选取2 个高倍视野。各组所选部位相同，用Image J 1.63 软件对β-gal 阳性细胞定量分析。

1.9 X-gal 染色

脑和肝脏组织制备20 μm 厚冠状切片，用0.5%戊二醛固定 10 min 后，在X-gal 溶液（5 mmol/L 铁氰化钾、5 mmol/L 亚铁氰化钾、2 mmol/L 氯化镁、0.01%脱氧胆酸钠、1 mg/mL X-gal）中孵育2 h。梯度乙醇脱水，封片，脑片扫描。蓝色所示为β-gal 阳性区，浅红色为脑缺血区。定量分析结果以β-gal 阳性区面积占脑缺血区面积的百分比表示。

1.10 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件包进行统计学分析，定量数据以x—±s 表示。组间比较采用t 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑缺血区HIF-1 的表达

免疫组织化学染色结果显示，dMCAO 模型建立1 d和5 d 后 HIF-1 在脑缺血区阳性表达（图1A）。Western blotting 结果见图1B，局灶性脑缺血1 d 和5 d 后，小鼠缺血病灶局部HIF-1 的表达水平较假手术组明显增高，差异有统计学意义（P=0.049，P=0.007）。

图1 HIF-1 在脑缺血区的表达Fig 1 Expression of HIF-1 in the ischemic area

2.2 脑缺血区β-gal 的表达

在dMCAO 模型建立1 h 后，将AAV9-H9LacZ 经颈静脉注入小鼠体内。dMCAO 模型建立后第5 日，处死小鼠，取脑组织制备切片。AAV9-H9LacZ 组和对照组可见左侧大脑中动脉区域出现缺血灶，提示造模成功。X-gal染色结果显示，AAV9-H9LacZ 组的脑缺血区周围（缺血半暗带区）可见深蓝色的β-gal 阳性表达，在缺血区中心可见少量的β-gal 表达，在其他区域偶见β-gal 表达，而对照组在脑缺血区周围和其他区域均未检测到β-gal 表达（图2A）。定量分析结果见图2B，2 组β-gal 阳性区占脑缺血区面积的百分比的差异有统计学意义（P=0.000）。提示经静脉注射的AAV9-H9LacZ 能通过BBB 进入脑部，并主要在缺血区周围表达。

图2 X-gal 染色检测β-gal 在脑缺血区的表达Fig 2 Expression of β-gal in the ischemic area detected by X-gal staining

2.3 脑缺血区β-gal 阳性表达的细胞类型

免疫荧光结果显示，脑缺血5 d 后大量β-gal 阳性细胞存在于脑缺血区周围。β-gal 阳性细胞主要表达星形胶质细胞标志物GFAP，少部分β-gal 阳性细胞表达神经元标志物NeuN，几乎未见β-gal 阳性细胞表达上皮细胞标志物CD31（图3A）。随机选取2 个视野（图3B），定量分析β-gal/GFAP 共表达、β-gal/NeuN 共表达以及β-gal/CD31 共表达的细胞数，发现β-gal/GFAP 共表达的细胞数最多（P=0.000），见图3C。

图3 脑缺血区β-gal 阳性表达的细胞类型Fig 3 Types of β-gal positive cells in the cerebral ischemic area

2.4 肝脏组织中β-gal 的表达

在小鼠的肝脏组织中，AAV9-H9LacZ 组及对照组未检测到明显的β-gal 表达（图4）。

图4 肝脏组织β-gal 的表达（X-gal 染色）Fig 4 Expression of β-gal in the liver tissue (X-gal staining)

3 讨论

中枢神经系统疾病基因治疗的关键是载体能够介导目的基因通过BBB 或者直接进入中枢神经系统。AAV 有多种血清型，许多AAV 载体不能通过正常的BBB，只能通过立体定向注射等有创方法将病毒注射至脑部。直接注射是一种侵入性的方法，可导致患者的额外伤害，因而制约了AAV 载体在中枢神经系统疾病基因治疗中的运用。

经静脉注射AAV9 载体能通过BBB，介导目的基因在脑部表达。但中枢神经系统以外的器官如肝脏、心脏、肾脏和骨骼肌等，也有目的基因的高表达。鉴于基因的过度表达会给宿主带来危害，因此如何调控基因的表达及其时间是基因治疗的关键。

既往研究[3]显示脑缺血模型建立1 h，用立体定向注射AAV1-H9LacZ 至脑缺血边缘区域能介导LacZ 基因在局部表达，注射至正常脑组织则无LacZ 基因表达。提示HRE 能控制目的基因仅仅在缺血和缺氧的条件下表达，为条件性地控制基因表达并进行治疗提供了新的方法。

本研究结果显示选用AAV9-H9LacZ（1×1012GC）这一剂量，能使目的基因主要在脑缺血部位有效表达。我们的研究显示在dMCAO 模型建立1 h 后静脉注射AAV9-H9LacZ 能通过BBB，介导LacZ 基因在缺血区及周围区表达。而正常脑组织和外周器官并未见到明显的LacZ 基因表达，提示AAV9-H9LacZ 不能介导目的基因在正常组织表达。因此，通过非侵入性地静脉注射AAV9-H9LacZ可以介导目的基因在脑部表达。dMCAO 模型建立1 d和5 d 后，小鼠脑缺血组织局部HIF-1 的表达增高，提示HRE 能限制基因在脑缺血区周围的表达，即9 拷贝的HRE 能控制治疗基因局限在缺血区及周边区域表达。

AAV9 能介导目的基因通过BBB[6]。主动转运在促进AAV9 跨越BBB 方面的作用机制已被证实[7]。在dMCAO模型建立后10 min 之内BBB 通透性增加，并持续至少24 h 至数日。本研究发现缺血周围区LacZ 基因表达明显高于脑的其他部位，提示除了AAV9 通过主动转运来通过BBB，脑缺血后的BBB 通透性增加可能也在其中起作用。

通过免疫荧光双染色，本研究发现经静脉注射的scAAV9 所介导的LacZ 基因主要转染GFAP 阳性细胞，少数NeuN 阳性细胞有LacZ 基因的表达，几乎无CD31 阳性细胞有LacZ 基因的表达。尽管其他研究表明静脉注射的scAAV9 能通过新生小鼠的BBB，主要转染神经元[8]，以及星型胶质细胞和小胶质细胞等[9]。但在成年小鼠中，scAAV9 能转染星型胶质细胞[10-11]。由于脑梗死后，星型胶质细胞迅速活化，活化的星形胶质细胞发生重要的形态学改变，如增生和肥大，形成胶质瘢痕，围绕损伤区形成物理和功能的壁垒[12]。鉴于脑缺血后局部神经元死亡，星形胶质细胞活化，我们推测在本研究中经静脉注射的ssAAV9 主要转染至GFAP 阳性的星形胶质细胞，而非神经元，这可能与脑缺血区大量神经元的死亡有关。

既往研究[5]显示静脉注射AAV9 和生理盐水组相比较，脑缺血体积无差异，提示静脉注射AAV 载体并不加重脑缺血损伤。AAV 具有能够在宿主细胞长期稳定表达、安全性高并与人类疾病无相关性、病毒本身稳定性好等多种优点[13]。

总之，本研究表明静脉注射ssAAV9 可介导基因通过成年小鼠BBB 通透性增加的相关区域。脑缺血后静脉注射ssAAV9 介导的基因主要在星形胶质细胞表达，部分在神经元表达。此外通过与调控元件HRE 的结合，目的基因可以被局限在脑损伤区域表达，以减少由于目的基因在全身其他器官表达所导致的不良反应。与调控元件结合的ssAAV9 可作为缺血性卒中及其他中枢神经系统疾病基因治疗的安全、有效的载体。

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