不同微生物处理对木质纤维素降解效果研究

孙 谱，孙婉薷，王 波，石占成，巩宏杰

(苏州大学，江苏 苏州 215123)

1 引言

枇杷(Eriobotryajaponica(Thund.)Lindl.)属蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya Lindl.)多年生常绿小乔木，因形似琵琶而得名，原产中国[1]，因其果肉细腻，保健价值高而深受消费者喜爱[2]，在我国长江以南各省均有种植，是南方一种较为常见的水果，具有较强的市场竞争力，市场前景广阔[3]。枇杷树因为生长旺盛，每年会产生大量的枝叶废弃物，因其含有大量的虫卵，如果不加以妥善处置，容易滋生病虫害，进而影响枇杷正常生长发育。将其堆制成有机肥就成为资源化利用枇杷枝叶的重要途径之一。

将枇杷枝叶堆制成有机肥存在诸多技术难点，其中一个重要的障碍就是废弃物中纤维素含量较高[4,5]，难以分解。当前，纤维素降解菌分解纤维素类物质的效果不佳，纤维素降解菌产酶量也相对较少，针对此种现象，大部分的研究人员多探究的是单一菌株对纤维素类物质降解效果，却忽视了将多种纤维素降解菌混合培养，很少探究复合菌群对纤维素的降解能力。大量的试验研究发现，仅仅依靠单一的菌株是很难将纤维素类物质充分降解。在复合高效微生物混合作用下，降解纤维素的效率比单一菌株效果更好，分解得更加彻底[6,7]。有很多学者还在研究复合微生物菌剂如何可以达到更好的效果。吴颖等人[8]通过调整菌种配比来降低各菌株间的拮抗作用，使复合菌剂效果更佳。为了加快木本废弃物中纤维素的降解速度，促进木本废弃物堆肥化的发展，建立复合菌团，即2种或2种以上的菌株相互作用，具有非常重要的意义[9]。

本研究室在先前试验中分离筛选出的3种纤维素高效降解菌株[10]，拟将这3种微生物分别称为A菌株、B菌株和C菌株，按照相互混合进行组合培养，通过滤纸条降解试验和测定纤维素含量的变化来说明不同菌团对木本废弃物的降解效果，同时将上述菌株按照不同处理添加进堆体材料中进行发酵试验，利用扫描电子显微镜观测不同微生物处理下不同发酵进程中堆体材料表面微生物分布、微观形态变化特征。从而构建筛选出高效的，为纤维素复合菌团降解木本材料提供理论依据，也为资源化利用枇杷枝叶提供技术支撑。

2 材料与方法

2.1 试验材料与培养基组成

(1)堆肥原料。由苏州市吴中区东山镇提供，将枇杷枝、叶按照7∶3比例混合，粉碎过筛备用。

(2)培养基：①液态改良高氏1号，KNO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，FeSO40.01 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，蒸馏水1000 mL。②赫奇逊(Hutchinson),KH2PO41.0 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NaNO32.5 g/L，FeCl30.01 g/L，CaCl20.1 g/L，蒸馏水1000 mL。上述培养基所用试剂均为分析纯，初始pH均调至7.2左右，并在121 ℃灭菌30 min。

2.2 滤纸降解与堆肥试验

将筛选获得的3种菌株(A菌株、B菌株和C菌株)按照体积比进行组合，设置8个处理，分别为处理1(菌株A)、处理2(菌株C)、处理3(菌株B)、处理4(菌株A+C)、处理5(菌株A+B)、处理6(菌株B+C)、处理7(菌株A+B+C)、处理8(对照，无菌株)。将上述8个处理菌种分别接种到液态改良高氏1号培养基中制备成菌液，30 ℃、160 r/min培养5 d。然后在含有1 cm×6 cm的滤纸条的赫奇逊氏培养基内加进1 mL的菌液，30 ℃、160 r/min培养10 d。

将枝叶混合物进行堆肥试验，每隔10 d从堆体中间离表层约15 cm处采集多点混合样，烘至恒重，粉碎过0.25 mm筛，待测。

2.3 样品测试与电镜观察

(1)降解试验。以“+”数量的多少来表示滤纸崩溃程度。“0”-滤纸几乎无变化；“+”为滤纸边缘出现膨胀；“++”为滤纸整体出现膨胀并已下弯；“+++”为滤纸呈现不定状；“++++”为滤纸呈现糊状。

(2)纤维素测定。细胞壁提取：称取约0.3 g枝叶混合样，加1 mL 80%乙醇，室温快速匀浆，90 ℃水浴20 min，冷却至室温，25 ℃、6000 r/min离心10 min，弃去清液，沉淀先后加1.5 mL 80%乙醇和丙酮各洗一遍，25 ℃、6000 r/min离心10 min，弃去清液，沉淀即为粗细胞壁，加试剂一1 mL，浸泡15 min，25 ℃、6000 r/ min离心10 min，弃去清液，将沉淀干燥，即为细胞壁物质，烘干备用。

纤维素提取与测试：称细胞壁物质约5 mg，加0.5 mL蒸馏水匀浆，用蒸馏水定容至0.5 mL，置冰水浴中，缓慢加入0.75 mL浓硫酸，混匀，冰水浴静置30 min，4 ℃、8000 r/min，离心10 min，取上清液，蒸馏水稀释20倍，用分光光度计在620 nm处测定吸光值。

纤维素(mg/g干重)=[(△A+0.0043)/7.875×V1]/(W×V1/V2)×20=3.17×(△A+0.0043)/W

(1)

式(1)中，V1:加入样本体积，0.3 mL；V2：加入提取液体积，1.25 mL；W：样本干重，约5×10-3g；20：表示样本稀释倍数。

(3)电镜观察。分别于第0 d，第11 d，第21 d采样。加入2 %的戊二醛进行固定，再用PBS缓冲液漂洗样品3次，每次10 min。然后对样品按浓度分别为30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %的乙醇溶液进行逐级脱水处理，每次为10 min，再用乙酸异戊醇置换 2 次，每次为15 min，并用二氧化碳临界点干燥仪进行干燥处理，继而用离子喷溅仪进行镀金，最后用JEOL JSM-6390A扫描电子显微镜进行观察。

2.4 数据处理与分析

数据分析使用Excel数据处理软件，数据统计分析采用SPSS17.0软件。

3 结果与分析

3.1 滤纸降解

添加微生物处理可以明显影响滤纸降解(表1)。处理20 d后，对照中滤纸几乎没有变化，而添加微生物处理的滤纸变化明显。复合菌团处理的滤纸降解程度明显高于单一菌株处理，A、B、C单一菌株处理降解速度较慢，在第20 d时滤纸边缘仅膨胀。而AC处理和BC处理分别在第18 d和第20 d出现滤纸下弯。整个试验以AB处理和ABC处理降解速度为最快，在第20 d时2个处理滤纸均呈不定状。

表1 不同微生物处理对滤纸条降解的影响(20 d)

3.2 纤维素降解

随着处理时间的增加，堆体材料中纤维素含量逐渐下降(表2)，添加0、1、2、3种微生物处理21d后堆体纤维素含量分别比起始纤维素含量分别下降13.09%、22.40%、31.83%和40.22%，添加ABC复合菌团处理的纤维素含量分别仅为添加0、1、2种微生物的68.79%、77.03%、87.69%，说明添加微生物种类越多，堆体材料中纤维素含量下降越多，降解堆体材料的能力就越强。

处理时间相同的情况下，如7 d、14 d和21 d，均以CK处理纤维素含量最高，添加微生物后，堆体纤维素含量均低于CK处理，且与CK的差异均达到显著水平，进一步说明添加微生物可以显著促进堆体降解。添加ABC复合菌团的堆体材料纤维素含量最低，且与其他处理的差异均达显著水平，说明采用ABC复合菌团处理堆体材料的降解效果最佳。

表2 不同微生物处理对堆体材料纤维素含量的影响 g/kg

3.3 微生物分布

图1显示，电镜照片显示发酵前样品的表面结构基本完整，样品的表面几乎没有微生物的分布(图1a)。随着发酵的进程推进(20 d)，微生物数量开始明显增多，广泛分布在样品的表面，并且在因堆体材料降解而出现的缝隙中也观察到微生物的存在(图1b、c)，所观察到的微生物形状大部分是球状体和丝状体。

图1 发酵时间对堆体材料表面微生物分布的影响

3.4 堆体材料结构

添加ABC复合菌团后，随着发酵时间的推进，堆体材料结构变化明显(图2)。发酵前呈纹理清晰的棒状结构，表面较为光滑平整、致密规整、纤维束排列整齐、均匀、平滑呈自然伸展状态(图2)。在添加ABC复合菌团一段时间后发现，原本光滑的棒状结构变得杂乱无章形状各异(图2b、c)，处理10 d后的表面开始出现破碎，纤维束也呈现断裂、粗糙、空穴的现象(图2)，发酵20 d后其致密有序结构遭到破坏，排列疏松且没有规则，有较多微生物附着在表面，甚至侵入内部，出现较多碎片结构(图2c)。

图2 发酵时间对堆体材料结构的影响

在同一时间(第10 d)，添加不同微生物(A处理、AB复合菌团处理、ABC复合菌团处理)的堆体材料结构差异明显(图3)。A处理的堆体材料表面比较完整光滑、排列方式很规则、结构致密有序、具有明显的纤维形态特点，能够观察到表面完整清晰的构造。而经过AB处理10 d后的堆体材料，其表面结构开始受到破坏，但仍然能够保持原有结构。添加ABC处理10 d后的堆体材料表面能观察到很多维管纤维素被切断并且显露出来，排列疏松且无规则。说明在本试验条件下，ABC复合菌团对枇杷枝叶形成的堆体材料分解效果最好。

图3 不同微生物处理(A,AB,ABC)对堆体材料结构的影响(10 d)

4 讨论与结论

枇杷废弃物中因含有大量的木质纤维素而导致降解困难。其中的纤维素由于氢键的作用以及它的外面包裹着大量的木质素和纤维素，其木质素是整体抗性结构成分，是一种非均相复杂的酚类聚合物，使其降解的难度非常大[10,11]。木质素是一种交联酚醛树脂，具有刚性，不易腐烂，堆肥过程中木质素的降解主要依赖于木质素分解酶，这也是木质素降解微生物分泌的一种胞外酶[12]。白腐真菌就是通过独特的细胞外氧化酶系统和细胞内酶系统，分泌的三种典型的木质素分解酶：木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)和铜基漆酶(Lac)，将木质素有效降解[13]。纤维素和半纤维素的早期降解是由于初始混合物中含有大量可降解的有机化合物，刺激了微生物生物量的增加和酶的合成。纤维素是由复杂的酶蛋白混合物组成，微生物产生的一系列酶(如纤维素酶和木聚糖酶)可以降解纤维素和半纤维素[14]。本研究通过滤纸条降解试验和测定纤维素含量的变化表明复合菌团可显著降低堆体材料中纤维素的含量，其中ABC复合菌团处理中纤维素含量由开始的29.37%降至最终的17.56%，降解率达到40.22%。说明在含较多木质纤维素的材料堆肥过程中，复合菌团比单一菌株具有更强的纤维素降解能力，其中复合菌团ABC具有最强的纤维素降解能力。通过扫描电子显微镜观察微生物堆堆体材料侵染过程可以发现，当微生物在侵入到发酵物内部时，其致密结构才可能发生改变，导致木质纤维素结构受到了不同程度的破坏，能够有效地加速其分解。

研究发现，虽然已经分离到200多种可降解木质纤维素的细菌、真菌和放线菌[15]，由于木质纤维素分子量大，结构复杂，难以被单一微生物降解利用，通常需要不同微生物菌株之间的协同作用，才能进行降解[16]。这可能是由于降解过程中菌株代谢过程中产生的乙酸等会抑制菌株的正常生长和降低纤维素酶的活性，而多种微生物组成的微生物复合菌团可相互作用形成一个微小稳定的生态闭环，不同种微生物菌株之间相互作用能有效提高木质纤维素的降解效率[8]。杨林丽[17]将各种菌种按照不同的组合方式组合到一起后，能够具有效果非常好的协同作用，起到促进纤维素类物质的降解。朴哲等[18]在试验中观察到，在秸秆堆肥发酵过程中几乎没有看到杆菌的存在。他们分析有可能是由于营养环境不足导致有些杆菌的微观形态接近于球形，所以没有被辨认出来。艾士奇等[19]研究发现经过复合菌团处理的样品表面致密结构随着发酵的进行，维管束纤维逐渐大面积被降解，发酵结束时，样品表面的完整结构被严重破坏，最难降解的外表皮上的蜡质硅化层大部分降解消失，只剩下部分严重木质化的表皮组织。黄得扬等[20]通过对菌株组合，将复合菌团作为接种剂应用于蔬菜废物和花卉秸秆的堆肥研究得到了类似的结果。