老年痴呆患者血清中miR-181a表达及临床意义

曹光军 武金程 王鹏飞

(鹤壁市人民医院神经内科，河南 鹤壁 458030)

老年痴呆是一种起病隐匿的进行性的神经系统退行性病变〔1〕。临床上的主要特征是记忆力障碍、执行功能障碍、失语、失用、失认及人格和行为的改变等。并且随着年龄的不断增加，其发病率也逐渐升高，严重影响患者的生活，给家庭也带来了极大的负担〔2〕。miRNA是广泛存在于动植物体内的非编码单链小分子RNA，稳定存在于外周血中，主要诱发蛋白质翻译抑制调控蛋白质表达，并参与肿瘤的形成、胚胎发育和免疫等诸多过程。以往血清miR-181a的研究方向主要是癌症及心血管疾病发展等方面，但有相关报告表示miR-181a能够影响大脑海马神经元突触生长，通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/糖原合成酶激酶(GSK)3β信号通路对神经元细胞的凋亡产生影响〔3,4〕，但目前尚未见miR-181a在痴呆患者血清中的表达及临床意义的具体研究结果。因此为了更好地了解血清miR-181a水平对老年痴呆症患者的意义，本研究主要探讨血清miR-181a水平与老年痴呆患者临床症状的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年2月至2018年12月在鹤壁市人民医院收治的74例老年痴呆患者作为研究对象，男44例，女30例；年龄60～72岁，平均(70.35±7.89)岁。其中阿尔茨海默病(AD)组35例，男22例，女13例，平均(72.65±6.75)岁；轻度认知功能障碍(MCI)组39例，男22例，女17例，平均(74.58±7.25)岁。并选择同期的健康老人45例作为对照组，男25例，女20例，平均(75.42±7.89)岁。三组对象的年龄、性别无明显差异(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：①AD组患者均符合美国国家衰老研究所(NIA)与AD学会(AA)AD 诊断标准〔5〕，MCI组患者符合Petersen〔6〕修订的MCI诊断标准；②AD患者的精神症状评分在14～23分，MCI患者的精神症状评分≥24分；③年龄≥60岁；④患者及家属知晓本研究内容，并签署知情同意书。排除标准：①严重肝肾功能不全；②患者病例资料不完整；③具有意识障碍，听觉障碍；④既往有精神病史。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1样本收集 获得患者及家属的同意后，使用无抗凝剂的采血管在清晨空腹状态下抽取外周静脉血5 ml，并以2 500 r/min离心10 min，再使用PE管提取清液，存放至-80℃冰箱内备用。

1.2.2血清miRNA提取 从-80℃冰箱将所有样品取出后向血清样本中加入比例为1∶5的QIAzol溶解试剂进行统一溶解，在室温下静放10 min，再参照miRNA试剂盒上面的步骤提取血清总miRNA，并使用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3荧光定量聚合酶检测血清miR-181a 采用美国Bio-Red公司的逆转录-试剂盒对SYBR Green real-time PCR进行操作，并使用广州锐博生物有限公司合成的miR-181a或U6特异性上、下游引物，反应体系为15 μl。其PCR仪器设置参数为95℃、2 min、40个循环，93℃、15 s、30个循环，70℃、1 min、30个循环。并利用CFX manager 3.0软件对Cq值进行分析，再通过2-△Ct法(△Ct=CTmiRNA-CTU6)计算miR-181a的相对表达量。

1.3观察标准与测定方法 对所有研究对象进行全面检测，根据身高、体重进行体重指数(BMI)的计算，但在检测前是除去研究对象的衣服、鞋、帽子等所有影响计算结果的因素。一般采用简单智力状态检查表(MMSE)，主要是从定向力、记忆力、注意力与计算力、回忆力及语言表达力等几个方面进行评定，其评分标准分别为10分、3分、5分、3分、9分，总分为30分，分数越高，表示认知患者认知功能越好，一般大于27表示认知功能正常，检测者均在安静环境下进行〔7〕。对于血清中同型半胱氨酸(Hcy)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、脂联素(ANP)水平表达量的检测，其中Hcy、TC、TG、ANP水平表达量的酶测定是采用北京强生生物科技有限公司的试剂盒进行操作；LDL-C、HDL-C是采用直接测定法严格按照说明书进行操作。

1.4统计学分析 运用SPSS19.0进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1三组临床资料比较 三组教育程度差异有统计学意义(P<0.05)。三组LDL-C、Hcy、ANP、MMSE两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组基本资料比较

2.2三组miR-181a表达水平的比较 AD组血清中miR-181a的表达水平(1.25±0.35)高于MCI组(0.75±0.45)、对照组(0.56±0.75)，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.3血清miR-181a表达与临床指标的相关性分析 进一步分析老年痴呆患者中血清miR-181a水平与其他临床血清指标的关系，其中血清miR-181a水平与血清Hcy水平呈正相关(r=0.568，P=0.004)，血清miR-181a水平与血清ANP水平、MMSE评分呈负相关(r=-0.562，P=0.001；r=-0.624，P=0.003)。

2.4老年痴呆患者采用Logistic回归分析比较 以老年痴呆患者有无痴呆为因变量(否=0、是=1)，采用Logistic回归分析，结果显示教育程度(高中以上)为老年痴呆患者的保护因素，血清miR-181a≥0.78、Hcy≥19.25 mmol/L为老年痴呆患者的危险因素。见表2。

表2 老年痴呆患者采用Logistic回归分析结果

3 讨 论

老年痴呆最为常见的是AD，是一种不可逆的慢性进展性疾病，病情隐匿，早期不易被发现，具体因素并不明确〔8〕。但目前主要与神经递质、遗传因素、免疫因素及环境因素等相关，主要特征性病理的改变是β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结及神经原丢失伴胶质细胞增生等〔9〕。随着病情的进一步发展患者逐渐出现了记忆力障碍、认知障碍、精神障碍及行为的异常，严重影响患者的社交、职业与生活功能〔10〕。目前对于老年痴呆患者的检查主要是影像学、脑电图、基因检测及脑脊液检测，但这些检测并不完善，不能在早期快速准确安全的诊断该疾病，存在一定的缺陷〔11，12〕。因此有相关的学者提出老年痴呆的发生与外周血的相关指标水平有一定的关系。

人类成熟miR-181家族存在4种，分别是miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d，既往研究发现miR-181家族更多是与肿瘤的发生发展相关〔13，14〕，但张仕娟等〔15〕研究发现急性脑梗死后认知功能受损患者血清miR-181c水平升高，血清miR-181c水平升高是急性脑梗死后认知功能受损的独立危险因素和预测指标。miR-181a的表达含量在神经组织中比较丰富，并与疾病的发生发展有着重要关系。有相关研究表明，miR-181a表达量过多会影响神经突触的分支数量及树突的发育状况，导致脑部疾病如AD的基因表达水平上升。miR-181a表达在AD的突触可塑性中起着重要作用，当其表达量过高时，可对哺乳动物的认知功能造成一定的障碍，并参与调控学习和记忆力等认知功能、神经再生及AD等神经疾病〔16，17〕。本研究结果表示患者的认知功能与血清中miR-181a表达水平上升有关；血清miR-181a和Hcy水平表达量上升，血清ANP水平和精神症状下降，可以反映患者的认知功能的严重程度。采用Logistic回归分析探讨血清miR-181a水平与老年痴呆的关系，结果表明血清miR-181a可反映患者痴呆的程度。

Hcy是一种人体内的含硫氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程的重要中间产物，但本身不参与蛋白质的合成〔18〕。有相关研究显示Hcy水平表达量过高，会降低人体的甲基化和抗氧化能力，容易导致老年痴呆的发生〔19，20〕。本研究结果显示血清Hcy与老年痴呆症的发生相关。ANP是由心房肌细胞合成并释放的肽类激素，主要是调节中枢炎症反应，保护血管内皮等作用，并有研究显示血清ANP水平量过高时MCI患者的病情发展较慢〔21，22〕。本研究表明血清ANP水平表达量与AD相关。

综上所述，检测血清miR-181a的水平表达量能够判断老年痴呆患者临床症状的严重程度，为患者的诊断及治疗提供了一定的参考。但是由于研究的样本量不足，因此更多研究结果，需进一步开展。