血清细胞因子水平对临床孤立综合征患者转归的预测价值

魏玉桢 苌浩晓 杜利 李昕頔 刘翕然 徐芸 尹琳琳 张星虎

临床孤立综合征(clinically isolated syndrome，CIS)是指首次发生的、存在临床症状和中枢神经系统(CNS)脱髓鞘事件的一组临床综合征，可急性或亚急性起病，症状持续时间至少24 h，伴或不伴病情恢复，无发热或感染[1]。部分CIS患者可出现复发，转归为其他CNS特发性炎性脱髓鞘病(idiopathic inflammatory demyelinating diseases，IIDDs)，如多发性硬化(MS)、复发性视神经炎、视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder，NMOSD)等[2-3]。既往关于CIS的研究多着眼于CIS向MS转化的预测[4-6]，对于CIS向NMOSD转归的预测缺乏相关报道。研究显示NMOSD和MS患者血清细胞因子水平存在差异[7-9]，CIS患者血清细胞因子水平对疾病转归的预测作用尚未见报道。本研究对CIS患者急性期血清部分细胞因子水平进行检查，并评估其预测疾病转归为MS或NMOSD的价值，旨在寻找预测CIS患者转归的生物标记物。

1 对象和方法

1.1 对象前瞻性收集2015年1月至2017年8月北京天坛医院神经感染与免疫科住院的CIS患者69例，其中男25例，女44例，年龄15～70岁，平均(41.6±14.7)岁。CIS诊断根据2010年McDonald’s 诊断标准[10]确诊。入组标准：(1)年龄15～70岁；(2)首次发病急性期(症状开始2周内)；(3)未使用免疫治疗，包括激素、丙种球蛋白、免疫抑制剂、疾病修正治疗、血浆置换等。排除标准：合并感染及其他自身免疫性疾病，合并严重心、肺、肝、肾功能受损等其他严重疾病，妊娠期及哺乳期妇女，无法完成腰穿或MRI检查者。

1.2 方法

1.2.1一般资料收集：记录患者性别、年龄、发病时间、扩展残疾状况评分量表(expanded disability status scale，EDSS)评分、血清水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)抗体(细胞间接免疫荧光法)、脑脊液检查(白细胞计数、蛋白、IgG指数、寡克隆带)以及影像学检查(头和脊髓MRI病灶部位、数量、强化情况、脊髓病灶长度)。

1.2.2血清细胞因子检测：患者出现症状2周内、免疫治疗前，采用惰性分离胶促凝管采集静脉血，室温下静置30 min，以3000 r/min离心10 min(离心半径=10 cm)，取血清分装于0.4 mL聚苯乙烯管中，3 h内置-80℃冰箱备用。采用Luminex液相芯片法(MILLIPLEX公司map human High Sensitivity Cytokine/Chemokine Panels Cat.Nos.HCYTOMAG-60K，HCYP2M AG-62K)检测血清白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-21、IL-23、γ干扰素(IFN-γ)水平；采用酶联免疫吸附测定法(NeoBioscience公司Human TGF-β1 ELISA kit EHC107b.96)检测转化生长因子(TGF)-β1水平。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。所有样品一式两份进行测定，取均值。对检测者设盲。

1.2.3治疗与随访：入组CIS患者均给予大剂量甲泼尼龙500 mg×5 d、250 mg×3 d、120 mg×3 d，后改为口服泼尼松60 mg，每周减10 mg，直至停药。除急性期给予激素治疗外，随访期间未给予其他免疫治疗。入组患者每3～6个月进行1次门诊随访，当病情需要时(出现新发症状或原有症状加重)进行不定期随访。随访内容包括EDSS评分、是否出现新发症状、药物使用情况，怀疑有临床复发时复查头/脊髓MRI平扫+增强。由两位资深神经内科医师共同判断患者是否出现临床复发[10]及是否确诊为NMOSD[11]或MS[10]。

1.3 统计学处理采用SPSS22.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，方差不齐时多组间均数比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距表示，两组间比较采用Mann-Whitney秩和检验，多组间比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验；计数资料比较采用卡方检验；采用受试者工作特征(ROC)曲线确定血清细胞因子的最佳截断点；采用Cox比例风险回归模型进行单因素分析细胞因子及临床特征对转归MS或NMOSD的预测价值，对单因素分析P≤0.20的因素进行多因素逐步Cox回归分析，计算风险比(hazard ratio，HR)值。取α=0.05。

2 结果

2.1 随访与复发随访时间9.5～39.9个月，中位数为23.1个月，其中63例(91.3%)患者随访时间超过1年，32例(46.4%)患者超2年。69例患者首次发病时血清AQP4抗体均阴性。20例(29.0%)患者随访期出现复发，复发距首次发病时间为4.4～35.4个月，中位数13.8个月，四分位数间距17.4个月。20例复发患者中，7例被确诊为MS，8例被确诊为NMOSD(1例血清AQP4抗体阳性)，3例诊断为复发性脊髓炎，1例诊断为复发性脑干脑炎，1例诊断为炎性脱髓鞘假瘤。3例患者未出现临床复发，但随访时行MR检查发现新发病灶，最终诊断为MS。

2.2 不同转归CIS患者临床特征比较随访期内转归为NMOSD 8例，MS共10例，未发生转归51例。MS组多部位病变者高于未转归组(P<0.05)，MS组存在大脑病变者比例高于NMOSD组和未转归组(P<0.05，P<0.01)，余临床特征各组间比较未见统计学差异(表1)。

2.3 不同转归CIS患者血清细胞因子水平比较见图1。NMOSD组、MS组及未转归组CIS患者首次发病急性期血清IL-21、IL-23、IFN-γ等细胞因子水平比较未见统计学差异(均P>0.05)。

表1 CIS患者不同转归组间临床特征比较

注：IL：白细胞介素，表2、图2同。IFN-γ：γ干扰素，TGF-β1：转化生长因子β1；表2同 图1 不同转归CIS患者血清细胞因子水平比较散点图

表2 CIS患者转归与未转归为NMOSD组血清细胞因子水平比较

表3 影响CIS患者转归为NMOSD的单因素及多因素Cox回归分析结果

2.4 CIS患者急性期血清细胞因子对转归为NMOSD的预测价值

2.4.1转归和未转归为NMOSD组患者血清细胞因子水平比较：转归NMOSD组血清IL-10水平低于未转归组(P=0.037)，两组间余血清细胞因子水平比较无统计学差异(均P>0.05，表2)。

2.4.2ROC曲线分析：血清IL-10判断CIS转归为NMOSD的AUC为0.72，95%CI为0.54～0.92(P=0.037，图2)，其判断转归为NMOSD的最佳截断点为1.32 pg/mL，其预测转归为NMOSD的敏感度为0.750，特异度为0.672。

2.4.3影响CIS转归为NMOSD的Cox回归分析：单因素Cox回归分析结果显示，血清IL-10<1.32 pg/mL、脊髓病灶≥3个节段与转归为NMOSD相关，但多因素Cox回归分析显示，血清IL-10<1.32 pg/mL和脊髓病灶≥3个节段不是CIS患者向NMOSD转化的预测因子(表3)。

2.5 是否转归为MS CIS患者血清细胞因子水平比较转归为MS患者10例，未转归MS患者59例。转归与未转归MS患者间各血清细胞因子水平比较未见统计学差异(表4)。

图2 CIS患者血清IL-10水平预测转归为NMOSD的ROC曲线分析结果

3 讨论

既往研究结果显示60%～70%的CIS患者在20年内会再发临床脱髓鞘事件[3，12]。复发的CIS患者可被诊断为临床确诊的MS、NMOSD、复发性视神经炎、复发性脊髓炎等。作者所在课题组前期研究中探讨了CIS急性期患者使用免疫治疗前血清细胞因子水平对CIS复发的预测价值，结果显示，血清IL-10水平降低是CIS患者出现二次临床脱髓鞘事件的预测因子[13]。本研究进一步探讨了血清细胞因子对CIS患者转归的预测价值，但未发现所检测的血清细胞因子对CIS转归为MS或NMOSD有预测作用。

随疾病进展，CIS的诊断常预示可能会发展为MS[4-6]。 视神经脊髓炎(NMO)曾被认为是MS中一种较重的亚型，但随着AQP4抗体的发现，学者们将NMO列为一种独立的疾病实体，并提出NMOSD的概念[14-15]。NMOSD与MS的临床表现、实验室、影像学、治疗和预后均有所差异，故CIS患者向NMOSD的转归问题有待进一步阐明。该研究结果显示，69例CIS患者在中位23.1个月的随访期内有10例确诊为MS，8例确诊为NMOSD，转归为MS者多于转归为NMOSD者。由于本研究样本量较小，随访时间较短，CIS转归为NMOSD和MS确切比例还有待于前瞻性大样本长期随访的研究进一步证实。

既往研究显示NMOSD患者及MS患者血清细胞因子水平不同[7-8，16-18]：NMOSD患者血清IL-6、IL-17、IL-21、IL-23水平较MS升高。本研究结果却发现转化为NMOSD和转化为MS的CIS患者首次发病时血清细胞因子水平存在统计学差异。其可能的原因为：(1)入组人群不同。既往研究入组人群均为确诊的NMOSD和MS患者，包含首次发病和复发人群，而本研究纳入的患者均为首次发病；既往研究NMOSD包括AQP4抗体阳性的NMOSD和阴性的患者，而本研究缺乏AQP4抗体阳性患者。目前对比AQP4抗体阳性和AQP4抗体阴性的NMOSD血清细胞因子水平的研究较少，作者团队前期研究显示首次发病的AQP4抗体阳性NMOSD患者细胞因子与MS患者水平的差异较抗体阴性的NMOSD患者更为显著[19]。本研究缺乏AQP4抗体阳性的患者可能使入组NMOSD与MS患者细胞因子水平差异缩小。(2)本研究样本量较小。

本研究结果显示转归为NMOSD的CIS患者血清IL-10水平低于未转归为NMOSD的CIS患者。IL-10是一种关键的免疫抑制细胞因子，在抑制炎性反应和自身免疫的发生中具有至关重要的作用[20-21]。本研究中转归为NMOSD患者血清IL-10水平的降低提示其改变在NMOSD患者的发病过程中可能起到一定作用。IL-10在预测CIS向NMOSD转归的单因素Cox分析中具有统计学意义，然而在多因素Cox分析中并未达到统计学差异，提示血清IL-10水平尚不能作为预测CIS向NMOSD转归的预测因子。鉴于NMOSD和MS的发病机制及治疗方式不同，目前预测和影响CIS向NMOSD转归的相关研究相对较少，尚需今后进一步深入研究。除此以外，本研究仅分析了首次发病急性期的细胞因子水平，而CIS患者向MS和NMOSD转化的过程中，细胞因子的水平是否也发生了变化？这种变化是CIS转化的原因，还是结果？这些问题亦有待今后深入研究。

本研究入组的CIS患者首次发病时血清AQP4抗体均为阴性，这可能是由于AQP4抗体阳性的患者多于首次发病时即被诊断为NMOSD有关。AQP4抗体为致病性抗体，在疾病发病之前即可检出[22]。这意味着AQP4抗体不会于CIS疾病发生后转为阳性。本研究患者随访中出现复发并确诊NMOSD的8例患者中，7例复发时血清AQP4抗体仍为阴性，被诊断为AQP4抗体阴性的NMOSD。然而，另外1例患者复发时血清AQP4抗体为阳性，这可能是由于细胞间接免疫荧光法检测AQP4抗体的敏感度有关(介于57%～91%之间[23-24])，不排除存在假阴性情况；另外一种可能性是患者的首次发作和复发分属于两个不同的临床过程。因此，临床医生应注意AQP4抗体检测的敏感性和特异度，注意复查复发患者的血清AQP4抗体情况。

综上所述，本研究结果显示，转归为NMOSD的患者血清IL-10水平低于未转归为NMOSD的患者，本研究所检测的血清细胞因子尚不能作为CIS患者是否转归为MS或NMOSD的标记物。由于本研究样本量较少，属单中心研究，仅检测首次发病时的血清细胞因子水平，未对细胞因子进行动态观察，此外未对免疫细胞进行观察，因此有关CIS患者转归为MS及NMOSD患者间血清因子的确切差异，以及其在预测CIS患者转归中的价值，尚需进一步研究。