188Re-cNGQGEQc放射性标记及其对肺腺癌细胞的抑制作用

李贵平，黄 凯，黄宝丹，齐永帅，池晓华，江 英

（南方医科大学南方医院核医学科，广东广州 510515）

肺癌是全球最常见、病死率最高的恶性肿瘤［1］，危害巨大，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%以上［2］，随着人们对肿瘤生物学和基因组学技术认识的迅速发展，NSCLC 已被公认为一种分子和基因组上复杂的异质性疾病［3］。尽管在早期发现和治疗方面取得了进展，但仍有很多患者出现局部晚期或转移性NSCLC，其预后仍然很差。为了进一步提高NSCLC 患者的临床疗效，需要新的靶点和治疗策略［3-4］。近年来，以整合素信号通路为靶点的肿瘤分子显像和靶向治疗的研究初现端倪［3-5］。我校郭琳琅教授［6］利用组合化学肽库技术筛选出一种能够与NSCLC 结合的小分子肽cNGQGEQc，用不同整合素抗体进行抑制实验，发现其与肺癌细胞的结合可以被整合素α3β1所阻断。而在多肽分子结构中连接上放射性核素则可利用射线的电离辐射作用来增强多肽的肿瘤杀伤效应，现有的研究资料已证实放射性标记多肽在肿瘤靶向治疗中的应用价值［7-8］。而放射性核素188Re 因可同时发射适于治疗的高能β-射线和用于SPECT 显像的γ射线而受到关注，是目前较理想的治疗性放射性核素之一［9-10］。为此，本文选择能与肺腺癌A549 细胞膜上整合素受体特异结合的cNGQGEQc 作为靶向载体，以双半胱氨酸作为188Re 标记的双功能螯合剂，建立188Re 对小分子肽的间接标记方法，在细胞层面通过体外实验观察188Re-cNGQGEQc 对肺腺癌A549 细胞的增殖抑制作用，为标记多肽体内靶向治疗的应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂及仪器

肺腺癌A549 细胞株（由中国科学院上海生科院细胞库提供），常规方法进行细胞的冻存、复苏、培养和传代，选用指数生长期的细胞进行实验。

无水乙腈、二甲基甲酰胺、三氟乙酸（TFA）、正辛醇、氯化亚锡（SnCl2·2H2O）、抗坏血酸、体积分数2.5 g/L 胰蛋白酶消化液和青链霉素双抗（美国Sigma-Aldrich 公司）；CCK-8 试剂盒（英国Abcam 公司）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；伯乐680 酶标仪（美国伯乐公司）；Sep-Pak C18 柱（美国Waters 公司）；CO2孵箱及细胞培养超净工作台（美国赛默飞公司）；TLC 薄层扫描仪（美国Bioscan 公司）；GC-911 型放射免疫γ计数仪（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；CRC-25R 活度计（美国CAPINTEC 公司）；188W/188Re 发生器（德国ITG 公司）。

1.2 小分子多肽的合成及偶联物的制备

肺腺癌整合素受体特异性靶向小分子多肽的氨基酸序列为cNGQGEQc，简称为阳性多肽；而对照小分子多肽的氨基酸序列为cNAQAEQc，简称为阴性多肽，由上海楚肽生物科技有限公司合成。

双半胱氨酸（ethylene dicysteine，EC）与阳性多肽偶联物的制备：在常规固相法合成阳性多肽cNGQGEQc 的过程中在其氨基端N 端连接EC，直接完成EC 对多肽的偶联，由上海楚肽生物科技有限公司合成；EC-cNGQGEQc 偶联物的分子量为1 201.37，合成纯度大于95%，符合实验设计要求。阴性多肽cNAQAEQc 与EC 的偶联方法同上述阳性多肽。

1.3 小分子多肽的188Re 标记技术

采用EC 作为双功能螯合剂的间接标记法进行188Re 标记小分子多肽。分别取氨基端连接有EC 的cNGQGEQc 阳性多肽和cNAQAEQc 阴性多肽溶液（1～10 g/L，生理盐水配制）20 μL，依次加入100 μL 的氯化亚锡溶液（10～50 g/L，1 mol/L HCl 新鲜配制，含100 g/L 的抗坏血酸），最后加入从188W/188Re 发生器中新鲜淋洗的37～111 MBq/100 μL 的Na188ReO4淋洗液，1 mol/L NaOH及1 mol/L HCl调节pH 至2.0，然后振荡混均，充氮气密封，置于37 ℃温育箱中孵育反应1 h。反应结束后，调整反应混合液pH 至中性，充氮其密封保存。标记率的测定采用纸层析法，具体测定方法参见文献［11］。

1.4 188Re 标记物的纯化和放化纯度测定

采用Sep-Pak C18 柱法进行188Re 标记多肽的分离纯化，方法如下：首先在加样前分别以甲醇、双蒸水和体积分数为0.1%TFA 各5 mL 依次通过Sep-Pak C18 柱，使其活化；然后将所制备的标记多肽上样后，将9.5 mL 的体积分数为0.1%TFA 与等体积的60%乙腈依次过柱进行洗脱，每管收集1 mL，测定每管的放射性计数；最后收集标记物待用。其中0.1%TFA洗脱C18柱上游离的188Re，60%乙腈洗脱液前3 mL 为标记物的放射性主峰。然后取10 μL 少许标记峰产物作纸层析分析，计算188Re 标记多肽的放化纯度。

1.5 188Re 标记物的体外稳定性及脂水分配系数测定

分别检测188Re-cNGQGEQc及188Re-cNAQAEQc在血清中的稳定性，测定方法如下：取10 μL 标记多肽，加入至1 mL 正常人新鲜血清中，振荡混匀，充氮气密封后放置于37 ℃水浴箱中孵育，分别于3、6 和24 h 3 个时间点取微量样品样进行纸层析测定，观察标记多肽的放化纯度变化情况，纸层析的方法参考文献［11］。

188Re标记多肽的脂水分配系数lgP测定：在EP管内分别加入1 mL 正辛醇和1 mL 双蒸水，同时取10 μL 标记多肽加入EP 管中，振荡混合10 min，然后使用加样器分别从EP上层液体（正辛醇）和下层液体（双蒸水）各抽取100 μL，分别加入试管中测量放射性计数（Cpm）。按下式计算脂水分配系数：lgP=lg（Cpm正辛醇/Cpm双蒸水）。重复实验3次。

1.6 188Re-cNGQGEQc对体外培养的肺腺癌A549细胞的增殖抑制试验

采用细胞增殖实验（cell counting kit-8，CCK-8）法测定体外培养的肺腺癌A549 细胞的增殖抑制效应，具体实验方法如下：取指数生长期的A549 细胞，以细胞浓度为6×103个/100 μL 将细胞接种于96 孔培养板上，设置3 个实验组，分别为188Re-cNGQGEQc（阳性多肽组）、188Re-cNAQAEQc组（阴性多肽组）和188ReO4-组，每组均设5 个放射性浓度级别，分别为3.7×107、18.5×107、37×107、55.5×107和74×107Bq·L-1，每个浓度设6 个平行孔（n=6），分别加入200 μL 上述放射性标记物，以只加入细胞和培养液且未加标记物者作为对照组，以只加入标记物和培养液且未加细胞者设为空白调零组，各组于孵育培养24 h 后取出，加入10 μL的CCK-8 试剂继续孵育2 h，取出96 孔板，用酶标仪检测450 nm 波长吸光度，计算相对抑制率和半数抑制浓度（IC50），比较和评价实验组3 种放射性标记物的体外肿瘤抑制效果。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0 对实验数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差（）表示，已通过正态性检验（K-S 检验），符合正态分布，采用Pearson 相关性分析；多组均数比较，各组定量资料都呈正态分布并且方差齐性采用ANOVA 进行分析，差异有统计学意义时采用LSD 法进行两两比较。方差不齐时采用Tamhane 方法进行两两比较。P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小分子多肽的188Re 放射性标记

188Re间接法标记小分子多肽的优化条件如下：多肽含量为20 μg，188ReO4-放射性活度为37 MBq，多肽/氯化亚锡质量比为1∶150，氯化亚锡与抗坏血酸的质量比为1∶3.3，pH 值为2，37 ℃下反应60 min。经多次标记实验，188Re-cNGQGEQc（阳性多肽）的标记率为（90.24±1.58）%，188Re-cNAQAEQc（阴性多肽）的标记率为（90.17±1.52）%。而经Sep-Pak C18 柱分离纯化测得两者的放化纯度分别为（98.42 ± 0.32）%和（98.31 ± 0.22）%。经计算188Re-cNGQGEQc 和188Re-cNAQAEQc 的比活度分别为（4.07±0.14）TBq/（mmol/L）和（4.03±0.07）TBq/（mmol/L）。

2.2 188Re 标记多肽的体外稳定性及水溶性分析

将标记多肽加入正常人血清中，放置于37 ℃水浴中孵育3、6 和24 h，纸层析法测得188RecNGQGEQc 的放化纯度分别为（95.91±0.40）%、（92.44±0.61）%和（89.08±0.94）%；而188Re-cNAQA⁃EQc 的放化纯度分别为（95.08±0.53）%、（91.94±0.54）%和（87.36±0.52）%。体外稳定性测定结果表明，188Re 标记多肽在37 ℃下正常人血清中放置24 h 其放化纯度仍大于85%，提示标记多肽体外较稳定。

188Re-cNGQGEQc和188Re-cNAQAEQc的脂水分配系数lgP值分别为（-2.90±0.03）和（-2.73±0.03），表明两种188Re标记多肽均具有良好的水溶性。

2.3 188Re-cNGQGEQc 对体外培养肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用

CCK-8 法检测188Re-cNGQGEQc、188Re-cNAQ⁃AEQc 和188ReO4-对肺腺癌A549 细胞的增殖抑制作用，双因素方差分析结果显示：三组之间的相对抑制率差异有统计学意义（F=12.825，P<0.01）；5 种放射性剂量之间的相对抑制率差异有统计学意义（F=40.266，P<0.01）。组间两两比较显示：在相同放射性剂量下，除放射性剂量为3.7×107Bq/L外，188Re-cNGQGEQc组的抑制作用明显强于188RecNAQAEQc组（P<0.05）和188ReO4-组（P<0.05；表1），而且188Re-cNGQGEQc 对肺腺癌A549 细胞的增殖抑制作用与放射剂量呈明显正相关（r=0.981，P<0.01）。

188Re-cNGQGEQc组的IC50值为44.88×107Bq/L，明显低于188Re-cNAQAEQc组（P<0.01）和188ReO4-组（P<0.01），后者的IC50值分别为93.45×107Bq/L 和99.60×107 Bq/L；而188Re-cNAQAEQc 组和188ReO4-组的IC50值差异无显著（P>0.05）。提示188Re-cNG⁃QGEQc 具有特异性抑制肺腺癌A549 细胞增殖的作用。

3 讨论

整合素在介导细胞间的粘附、增殖分化、信号转导、肿瘤发生、肿瘤生长和转移等方面发挥了重要作用［12］。整合素的过度表达在包括NSCLC在内的许多癌症类型中都有报道，是目前主要的抗癌药物靶点［4，12-13］。目前用于肿瘤治疗的整合素受体靶点主要有αvβ3、α4β1 和α3β1 等［12-15］，使用“一珠一肽链”的组合化学肽库技术发现在各种癌症中过度表达的整合素（α4β1、α3β1 和αvβ3）的配体，并作为运送其他药物或纳米药物的载体治疗肿瘤［12，16］。α3β1 整合素在胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多种癌症中均过度表达，并与预后不良、肿瘤发生、肿瘤侵袭、转移和对癌症治疗的抵抗有关。因此，α3β1 整合素被认为是一种有前途的肿瘤特异性生物标志物和药理靶点［4］。多肽受体放射性核素治疗（peptide recep⁃tor radionuclide therapy，PRRT）是一种非常有效的抗癌治疗方式，正成为核素靶向治疗肿瘤研究的热点［7-8，17-18］，PRRT 具有精准靶向，疗效确切，毒副作用小等特点，尤其适用于无法手术切除的神经内分泌肿瘤（NETs）。在前期使用“一珠一肽链”的组合化学肽库技术成功地识别并表征了一种与肺腺癌整合素受体发生特异性结合的小分子肽cNGQGEQc，并进一步证实其可与肺癌细胞表面的整合素α3β1 结合。考虑到目前尚无针对α3β1整合素的肿瘤治疗方法，本文作者进一步利用放射性核素99mTc 和131I 标记小分子肽cNGQGEQc，并进行动物SPECT 显像研究，以及131I-cNGQGEQc 对肺腺癌NCI-H1975 荷瘤裸鼠的靶向放射治疗试验，并获得较满意的效果［19-20］。为此，本研究选择目前较理想的放射性核素188Re，采用EC 作为双功能螯合剂的间接标记法对小分子多肽进行放射性标记，探索和建立188Re 标记多肽的方法学，并确定最佳标记条件。

表1 CCK-8 测定各组不同放射性浓度下对体外培养A549 细胞增殖的抑制率Table 1 Inhibitory rate of188Re label of different radioactivity on the proliferation of A549 cells measured by CCK-8 assay［，（%）］

表1 CCK-8 测定各组不同放射性浓度下对体外培养A549 细胞增殖的抑制率Table 1 Inhibitory rate of188Re label of different radioactivity on the proliferation of A549 cells measured by CCK-8 assay［，（%）］

The difference of relative inhibition rate between the three groups was statistically significant（F=12.825，P<0.01）and the difference of relative inhibition rate among the five radioactive doses was statistically significant（F=40.266，P<0.01）.1）P<0.05，compared with188ReO4-，n=6；2）P<0.05，compared with188Re-cNAQAEQc，n=6；3）P<0.05，compared with188ReO4-.

188Re 和99mTc 同属于元素周期表Ⅶ族元素，具有类似的化学性质，标记时需要借助还原剂如SnCl2·2H2O 将188Re 从高价态（+7）还原至低价态（+2 或+4），方可与多种配体和双功能螯合剂结构中的分子基团络合形成稳定的配合物。尽管如此，用于99mTc 标记的双功能螯合剂（DTPA、HYNIC和MAG3等）并不适合于188Re 的标记。而三羰基化合物因能够与188Re 稳定的螯合得到高产率的三羰基铼离子［（188Re（OH2）3（CO）3）+］而令人瞩目［21］，但其缺点是需预先制备三羰基铼离子，然后再将三羰基铼螯合物偶联至多肽分子中，标记条件复杂繁琐，需要多步反应方可完成188Re 的标记，而且在标记过程中需要使用对人体有害的气体CO并不断地充入硼氨酸（NH3BH3）的密封小瓶中，因此无法实施简单易行的一步法188Re 标记试剂盒的制备［21-22］。在本文研究中，选择双半胱氨酸（EC）作为双功能螯合剂，在小分子多肽cNGQGEQc 固相合成中通过共价键完成EC 与多肽氨基端的偶联以及188Re 的一步法标记。实验结果表明，在多肽含量为20 μg，188ReO4-放射性活度为37 MBq，以SnCl2·2H2O 为还原剂，抗坏血酸为稳定剂，多肽/SnCl2·2H2O 质量比为1∶150，SnCl2·2H2O 与抗坏血酸的质量比为1∶3.3，pH 值为2，37 ℃温育反应60 min，即可达到90%的标记率，说明188Re 能够有效地螯合在EC的N2S2分子环中。188Re-cNGQGEQc经C18 柱纯化后，放化纯度可达98%以上，其脂水分配系数为-2.90±0.03，表明具有较好的亲水性，在37 ℃正常人血清中孵育24 h 放化纯度仍大于85%，提示具有较好的体外稳定性，能够满足放射性药物的基本要求。

188Re 因其理想的核物理性能［T1/2=16.9 h，Eβmax=2.12 MeV，Eγ=155 KeV（15%）］以及很方便地按需通过188W/188Re 发生器淋洗获得高比活度的188Re 而特别引人注目［23］。188Re 可同时发射β-和γ两种射线，β-射线的平均能量784 keV，最大组织穿透力约11 mm，足以穿透和破坏靶向的肿瘤组织，同时避免对邻近正常组织造成不必要的辐射损伤；而188Re 还可同时发射出能量为155 keV的γ射线，适用于体外SPECT 显像以观察药物在体内的生物分布、监测治疗效果和评估辐射吸收剂量。在成功地利用EC 作为双功能螯合剂、SnCl2·2H2O 作为还原剂以及抗坏血酸作为稳定剂建立了标记率高且稳定性良好的188Re-cNGQGEQ 标记方法的基础上，本实验从细胞层面采用CCK-8 法观察188Re-cNGQGEQc 对体外培养的肺腺癌A549细胞增殖抑制作用，结果显示188Re-cNGQGEQc（阳性多肽）对肺腺癌A549 细胞的增殖具有显著的抑制作用，且与放射剂量呈明显正相关；其中188Re-cNGQGEQc 的抑制作用在相同放射性剂量下，除低浓度的放射性剂量（3.7×107Bq·L-1）外，均明显强于188Re-cNAQAEQc 和188ReO4-，而188RecNAQAEQc 和188ReO4-的抑制作用除放射性剂量为37×107Bq·L-1和55.5×107Bq·L-1外均无显著差异。188Re-cNGQGEQc 的半数有效抑制浓度（IC50）为44.88×107Bq·L-1，明显低于188Re-cNAQAEQc 的93.45×107Bq·L-1和188ReO4-的99.60×107Bq·L-1。我们的研究结果提示188Re-cNGQGEQc具有特异性杀伤A549细胞株的作用。小分子多肽cNGQGEQc通过与A549 细胞膜上的整合素α3β1 受体特异性结合而将携带的188Re 固定至肿瘤细胞膜上，通过这种特异性结合机制延长标记多肽的辐射杀伤作用时间以及利用β-射线的“交叉火力”作用杀伤邻近未结合标记多肽的A549 细胞，从而增强了188Re-cNGQGEQc 杀伤A549细胞的辐射生物效应；而阴性多肽（188Re-cNAQAEQc）及188ReO4-两者均不能与A549 细胞发生特异性结合，在加入培养板孔中培养以及吸取药物浸洗后，其辐射杀伤作用也随之中止，因而对A549 细胞的杀灭作用较弱。本研究不足之处仅从体外细胞层面评价188Re-cNGQGEQc 杀伤肿瘤细胞作用，后续将在荷瘤裸鼠动物模型上评价标记多肽对移植肿瘤的特异性靶向定位和放射治疗效果。

综上所述，本文利用EC 作为双功能螯合剂建立了标记率高、放化纯度高、稳定性良好的188Re 标记小分子多肽的间接标记法，并且188RecNGQGEQc 可有效地抑制体外培养的A549 细胞的增殖，本文研究结果为进一步开展基于整合素α3β1 为靶点的NSCLC 的PRRT 治疗应用提供实验基础。