MiR-204-3p靶向EphB2调控非小细胞肺癌的作用机制

谢传华 ，陈海龙，黄 萍，郭守俊，邱伊连，王 硕，潘宜云，胡志苹

（1.赣州市肿瘤医院内一科，赣州江西 341000；2.赣南医学院生理教研室，赣州江西 341000）

肺癌是全球发病率与死亡率最高的恶性肿瘤，发病率呈逐年升高趋势，严重公众卫生健康［1-2］。肺癌病理类型主要分为非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）与小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）［3］。其中NSCLC 占比约80%以上，是肺癌主要的存在形式，且NSCLC 易出现早期远处转移与侵袭的特点［4-5］。microRNA 是一类经典的非编码的单链小RNA，长度在22 个核苷酸左右［6-7］。microRNA 的存在非常广泛，可调控多项生命活动，且microRNA 在物种间高度保守，是目前肿瘤学领域研究的热点［8-9］。目前有多项研究表明，microRNA 与肺癌发生进展关系密切，深入研究microRNA 对探究肺癌分子机制具有重要意义［10-11］。有研究表明，miR-204-3p 可抑制大肠癌、胃癌、宫颈癌、和胰腺癌等［12-15］。miR-204-3p对肺癌的调控机制的研究罕见报道。EphB2 是一种络氨酸蛋白激酶受体，在癌症的进程中起重要的作用，研究指出该蛋白受miRNA 调控［16-18］。但目前尚无研究证实miR-204-3p 与EphB2 在NSCLC 中的调控关系。因此，本研究将明确miR-204-3p/EphB2 在NSCLC 中的作用及其机制，有助于丰富NSCLC 的发生发展机制，及为靶点治疗提供指导方向。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

非小细胞癌A549 细胞系购自美国ATCC 细胞库（Rockville，MD，USA），DMEM（Gibco，Life Technologies，美国），PGL3 载体（Genefarma，上海，中国），LipofectamineTM2000（Invitrogen，San Diego，美国），MTT 溶液（Sigma，美国），自动酶标读数仪检测（BIO-RAD，Cal，美国），Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒（4030ES20，Sigma，美国），GaliOS 型号流式细胞仪（Beckman Coulter，美国），Trizol（Invit⁃rogen，Calsbad，美国），兔多抗EphB2（ab252935，Abcam，美国），GAPDH（ab128915，Abcam，美国）。

1.2 实验分组

A549 细胞在DMEM 培养，加入10% 胎牛血清、50 U/mL 青霉素和50 mg/mL 链霉素，在37°C、体积分数95%空气和5% CO2的环境下生长。构建miR-204-3p 及EphB2 重组载体，转染A549 细胞后，分组进行后续实验。将细胞分为5 组：NC mimic 组（miR-204-3p 过表达阴性对照组）、miR-204-3p mimic组（miR-204-3p过表达组）、oe-NC组（EphB2 过表达阴性对照组）、oe-EphB2 组（EphB2过表达组）、miR-204-3p mimic+oe-EphB2 组（miR-204-3p 与EphB2 均过表达组）。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT实验 细胞转染24 h后，取对数生长期的细胞，用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640 培养基制备成2.5×105个/mL 的细胞悬液，接种到96孔培养板，根据实验分组，每组各设8 孔，每孔100 μL，置于37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，分别于培养12、24、36、48、72 h 时取出培养板，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL 继续培养4 h，终止培养后，弃上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使其充分溶解，自动酶标读数仪检测570 nm 处测定各孔吸光度（OD）值。

1.3.2 流式细胞术 转染细胞24 h 后，收集细胞，PBS洗涤3次，离心并丢弃上清液，重悬浮后将细胞浓度调整到约1×105/mL。在-20 ℃预冷75%乙醇，吸取1 mL 乙醇固定细胞，反应1 h 后，吸去乙醇，PBS 洗涤2 次，离心并丢弃上清液，加入100 μL RNase A，在37 ℃，避光的条件下孵育30 min，然后加入400 μL PI 染色，混合，4 ℃下暗反应30 min，GaliOS 型号流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）记录488 nm 处荧光强度，检测各组细胞周期分布情况。

转染24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，收集在流动管中，离心，并丢弃上清液。PBS 洗涤细胞3 次，离心除去上清液。根据Annexin VFITC 凋亡检测试剂盒的操作说明，将Annexin VFITC、PI、HEPES 缓冲液按1∶250 的比例制备染液。每100 μL染料溶液再悬浮大约1×106个细胞，摇匀。室温下孵育15 min 后，加入1 mL HEPES 缓冲液，摇匀。在488 nm 处，分别激发525 和620 nm带通滤波器，检测FITC 和PI 荧光，从而得到各组细胞凋亡情况。

1.3.3 Transwell 试验 细胞转染24 h 后，将Tran⁃swell 小室放置在24 孔板中，小室底部膜的上室面通过Matrigel 1∶8 稀释液包被，以室温进行风干；将各组细胞进行常规消化后，用过滤后的PBS 轻洗2 次，RPMI 1640 培养基将细胞重悬，将细胞密度大至调整到1×105个/mL，取200 μL 的悬液，移入到已处理的小室底部膜的上室面，另外取含有20%胎牛血清的培养基600 μL，加入下室。正常培养24 h 后，取出小室，去除上室内面多余的细胞，40 g/L 的多聚甲醛进行固定，15 min 后，使用0.5%的结晶紫染液进行染色。用过滤好的PBS 进行清洗，洗去多余染液。使用倒置显微镜观察，随机选取其中5个视野，拍照并计数穿膜的细胞数目。

1.3.4 细胞划痕实验 将转染24 h 的A549 细胞接种于6 孔板上，贴壁后用无血清DMEM 培养基代替。当细胞融合度达到90%～100%时，10 μL 枪口垂直于6孔板底部进行缓慢划痕，每孔约4～5处划痕，以保证每一处划伤的宽度相同。然后用已过滤与预冷的PBS 冲洗细胞3 次，放置在细胞培养箱中24 h 后，观察划痕区的移动距离，随机选取多个视野，对视野进行拍摄。使用ipp7.0 软件进行细胞融合率分析。

1.3.5 PGL3 重组载体构建和鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳后切出目的条带，用试剂盒纯化PCR 产物后再次电泳确认。确认以后使用XhoⅠ酶、HindⅢ酶对胶回收纯化产物和空白载体pGL3.0-Basic进行37℃双酶切过夜，用同样的方法纯化回收过夜的酶切物。将纯化后的pGL3.0-Basic 载体和CTGF 片段进行连接反应。连接体系为酶切纯化后pGL3.0-Basic 载体2 μL、酶切纯化后CTGF 片段4 μL、T4 DNA 连接酶0.8 μL、T4 DNA 连接酶缓冲液（5×）2 μL、双蒸水1.2 μL，共10 μL 体系，置于PCR 中16 ℃连接过夜。连接后的产物使用超级感受态细胞TreliefTM5α进行转化，之后将细胞沉淀接种到含氨苄霉素的LB 固体培养平板中培养筛选过夜。在每个培养平板中选取5 个单克隆菌落，各用5 μL 的无菌水溶解得到菌液，取2 μL 作为模板进行菌落PCR，扩增后采用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定；剩余3 μL 菌液加入到3 mL 含氨苄霉素的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养过夜，然后小提质粒。提取得到的质粒用XhoⅠ酶、HindⅢ酶双酶切2 h，琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段是否插入。对经过初步鉴定的质粒进行测序。

1.3.6 双荧光素酶报告分析 构建靶基因NC mim⁃ic、miR-204-3pmimic、PGL3-EphB2wt 和PGL3-EphB2mut 载体，将NC mimic、miR-204-3p mimic载体分别与PGL3-EphB2 wt和PGL3-EphB2 mut 载体共转至HEK 293T 细胞中。在细胞转染24 h 后，进行双荧光素酶检测。首先将各组细胞裂解，裂解后以13 000×g离心1 min，去沉淀，收集上清液。双荧光素酶报告试剂盒（E1910，Promeg，美国威斯康辛州麦迪逊市），按照试剂盒操作，测量荧光素酶活性。操作步骤如下：将裂解后的细胞样品吸入EP管中，每10 μL样品中加入萤火虫荧光素酶工作溶液100 μL，测得萤火虫荧光素酶活性之后加入海肾荧光素酶工作溶液100 μL，测得海肾荧光素酶活性结果。最后荧光素酶活性比值由萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性获得。

1.3.7 实时荧光定量 PCR 细胞转染24 h 后，收集细胞，冷PBS 清洗细胞1 次，由Trizol 提取各组组织中总RNA。根据TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription primer（4427975，Applied Bio⁃systems，USA）的说明进行转录以产生cDNA，取2 μL cDNA 稀释至50 ng/μL，PCR 扩增体系是20 μL。逆转录反应条件：37 ℃反应30 min，85 ℃反应5 s。miR-204-3p、U6、EphB2、GAPDH的引物由北京擎科生物科技有限公司进行合成（表1）。使用定量PCR 仪进行实时定量PCR。反应条件是在预变性95 ℃反应10 min，变性95 ℃反应10 s，退火60 ℃反应20 s，35 个循环。PCR 体系为20 μL：qPCR 正向引物（10 μmol/L）0.8 μL，qPCR 反向引物（10 μmol/L）0.8 μL，ROX 参考染料Ⅱ0.4 μL，SYBRPremix Ex TaqTMⅡ10 μL，cDNA模板2.0 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL。其中miR-204-3p的相对表达以U6作为内参，EphB2mRNA 相对表达以GAPDH的表达作为内参。2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平，公式如下：ΔΔCT=ΔCt实验组-ΔCtGAPDH，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参。其中Ct 表示qPCR 的扩增循环数。

1.3.8 Western Blot 细胞转染24 h 后，收集细胞，冷PBS 清洗细胞1 次，Western blot 检测各组细胞中EphB2 蛋白的表达。RIPA（BB-3209，Bebe Bio，中国上海）提取细胞中总蛋白。将蛋白样品置于沸水浴中10 min，完成蛋白质变性处理。通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，在80 V 的恒定电压下转移至NC 印迹膜。5%脱脂牛奶封闭溶液1 h后，加入一抗兔多抗EphB2，GAPDH，在摇床中，4 ℃下封闭过夜。TBST在室温下洗涤3次，每次洗涤5 min。将HRP 标记的山羊抗兔IgG（ab150077，Abcam，USA）在37 ℃下振荡孵育2 h。用TBST 在室温下洗涤3 次，每次洗涤5 min，将PVDF 膜进行显色。蛋白相对表达=蛋白带灰度值/相同样品GAPDH 带灰度值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.9 EphB2 数据获取 非小细胞肺癌中EphB2基因的生存分析数据，来自表达谱动态分析（Gene Expression Prolifing Interactive Analysis，GEPIA）数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/），GEPIA 数据库是基于9 736 个来自癌症和肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TGCA）、基因型组织表达（Genotype Tissue Expression，GTEx）数据库的8 537个正常样本的基因表达分析的相互式Web 应用程序。对肺鳞癌和肺腺癌中EphB2表达分析，以正常组织表达为基线，设置分组阈值：EphB2表达＞50%为高表达组，＜50%为低表达组，共计960 例肺癌组织（肺腺癌+肺鳞癌）纳入生存统计分析，以Log-rank test 进行假设检验分析。

1.3.10 统计学分析 IBM SPSS 21.0进行统计学分析，呈正态分布的计量数据用均数±标准差表示。多组均数比较时，各组定量资料都呈正态分布并且方差齐性采用One way-ANOVA 进行分析，差异有统计学意义时采用Bonferroni法进行两两比较。检验水准α=0.05，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-204-3p 及EphB2 对A549 细胞增殖的影响

我们通过MTT检测各组细胞增殖情况（图1），结果显示，和NC mimic 组相比，miR-204-3p mimic组细胞增殖能力显著降低（P<0.05）。和oe-NC组相比，oe-EphB 组细胞增殖能力显著升高（P<0.05）。和miR-204-3p mimic 组相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 组细胞增殖能力显著升高（P<0.05）。以上结果表明miR-204-3p 过表达会抑制A549 细胞增殖，而EphB 过表达则会促进A549 细胞增殖，且EphB 过表达会阻断miR-204-3p 对A549 细胞增殖的抑制作用。

2.2 miR-204-3p 及EphB 对A549 细胞周期及凋亡的影响

为探究miR-204-3p、EphB 对A549 细胞周期和凋亡的影响，我们通过流式细胞术分别检测各组细胞周期（图2A、B）和凋亡情况（图2C、D），结果显示，和NC mimic 组相比，miR-204-3p mimic组细胞G0/G1 期细胞比例显著升高，S 期细胞比例显著降低，细胞凋亡比例明显升高（P<0.05）。和oe-NC 组相比，oe-EphB 组细胞G0/G1 期细胞比例显著降低，S 期细胞比例显著升高，细胞凋亡比例明显降低（P<0.05）。和miR-204-3p mimic组相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 组细胞G0/G1 期细胞比例显著降低，S 期细胞比例显著升高，细胞凋亡比例明显降低（P<0.05）。以上各组细胞G2/M 期细胞比例均无显著性差异（P>0.05）。以上结果综合表明miR-204-3p 会抑制周期进程，促进细胞凋亡，EphB 会促进周期进程，而抑制细胞凋亡，且EphB 过表达会阻断miR-204-3p对A549细胞周期进程的阻滞作用以及对细胞凋亡的促进作用。

图1 miR-204-3p 及EphB 过表达对A549 细胞增殖能力的影响Fig.1 Over-expression of miR-204-3p and EphB effects on proliferation of A549 cells

图2 miR-204-3p 及EphB 过表达对A549 细胞周期及凋亡的影响Fig.2 Over-expression of miR-204-3p and EphB effects on cell cycle and apotosis of A549 cells

2.3 miR-204-3p 及EphB 对A549 细胞侵袭能力的影响

Transwell 检测各组细胞侵袭情况（图3A、B），结果显示，和NC mimic 组相比，miR-204-3p mimic组细胞侵袭能力显著降低（P<0.05）。和oe-NC组相比，oe-EphB 组细胞侵袭能力显著升高（P<0.05）。和miR-204-3p mimic组相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 组细胞侵袭能力显著升高（P<0.05）。以上结果表明miR-204-3p 过表达会抑制A549 细胞侵袭，而EphB 对A549 细胞侵袭能力的影响则刚好相反，且EphB 过表达会阻断miR-204-3p 对A549 细胞侵袭的抑制作用。

2.4 miR-204-3p 及EphB2 对A549 细胞迁移能力的影响

划痕实验用于检测各组细胞侵袭情况（图4A、B），结果显示，和NC mimic 组相比，miR-204-3p mimic 组细胞迁移能力显著降低（P<0.05）。和oe-NC 组相比，oe-EphB 组细胞迁移能力显著升高（P<0.01）。和miR-204-3p mimic 组相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 组细胞迁移能力显著升高（P<0.05）。以上结果表明miR-204-3p 过表达会抑制A549 细胞迁移，EphB 明显促进A549 细胞的迁移能力，且EphB 过表达会阻断miR-204-3p 对A549 细胞迁移的抑制作用。

图3 miR-204-3p 及EphB 过表达对A549 细胞侵袭能力的影响Fig.3 Overexpression of miR-204-3p and EphB effects on invasion of A549 cells

图4 miR-204-3p 及EphB 过表达对A549 细胞迁移能力的影响Fig.4 Over-expression of miR-204-3p and EphB effects on migration of A549 cells

2.5 miR-204-3p 与EphB2 之间的调控关系

我们通过生信网站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查询发现miR-204-3p与EphB2之间存在结合位点（图5A），为进一步探究miR-204-3p 与EphB2 之间是否存在调控关系，我们首先通过双荧光素酶报告分析进行检测（图5B），结果显示，和NCmimic 相比，miR-204-3pmimic 与EphB2wt共转染后，EphB2wt 报告载体荧光素酶活性显著降低，这表明miR-204-3p会显著抑制miR-204-3p的活性。为探究在A549 细胞中，miR-204-3p 是否会影响EphB2 的表达，我们分别通过qRT-PCR（图5C）和WB（图5D）检测各组细胞中miR-204-3p 和EphB2 的表达情况，结果显示，和NC mimic组相比，miR-204-3p mimic 组细胞中miR-204-3p表达升高，EphB2 mRNA 和蛋白表达降低（P<0.01）。和oe-NC 组相比，oe-EphB 组miR-204-3p表达无显著性差异（P>0.05），EphB2 mRNA 和蛋白表达升高（P<0.01）。和miR-204-3p mimic 组相比，miR-204-3p mimic+oe-EphB 组miR-204-3p表达无统计学差异（P>0.05），EphB2 mRNA 和蛋白表达升高（P<0.01）。以上结果综合表明，在NSCLC中，miR-204-3p 可靶向抑制EphB2 的表达。

2.6 miR-204-3p 与EphB2 在NSCLC 的表达及预后关系

查询TGCA数据库，进行统计分析发现NSCLC中mir-204-3p与EphB2表达呈负相关（r=-0.636，P=0.000，n=66），差异有统计学意义（图6A）。利用GEPIA 数据库分析TGCA 来源的NSCLC（肺腺癌+肺鳞癌），结果显示EphB2高表达的NSCLC 较EphB2低表达总生存时间短（logrank χ2=3.899，P=0.049，n=480；图6B），提示EphB2高表达是NSCLC不良预后的标志分子。

3 讨论

NSCLC 是肺癌最常见的病理类型，占所有类型的80%以上［19-20］。目前NSCLC 的治疗主要采取放疗、化疗及手术等综合治疗，但中晚期患者总体生存预后较低［21-23］。近年来，靶向治疗及免疫治疗逐渐进入公众视野，是癌症治疗的趋势。尽管有大量的基础研究，但NSCLC 的发病机理仍不明确，探寻更多的确切有效的靶点是目前研究的热点难点。

图5 miR-204-3p 靶向下调EphBFig.5 MiR-204-3p targeted down-regulation of EphB

图6 非小细胞肺癌中miR-204-3p 与EphB2 表达相关性Fig.6 Correlation between miR-204-3p and EphB2 expression in non-small cell lung cancer

MicroRNA（miRNA）是非编码RNA 之一，广泛存在于动物、植物和微生物中，在功能上广泛参与细胞分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成等［24］。miR-204-3p 属于microRNA 家族成员之一，是miR-204 的成熟体之一。Zhang 等［25］研究发现miRNA-204作为抑癌基因，其过表达可显著抑制NSCLC 进展。研究报道在胃癌、胰腺癌、食管癌等中miR-204-3p 高表达，发挥抑制细胞增殖、凋亡和侵袭作用，进而抑制肿瘤的发展［24-26］。而miR-204-3p 在NSCLC 中的作用尚不清楚，在本研究中，我们通过在A549 细胞中过表达miR-204-3p，明显抑制NSCLC 的增殖、迁移及侵袭能，并阻滞在G0/G1 期促进细胞凋亡。因此，miR-204-3p在NSCLC 中发挥抑癌作用，其下游调控机制有待进一步研究。

MicroRNA 可以通过与靶基因3′-非翻译区（UTR）特异结合，使靶基因降解或翻译受阻，从而在转录水平后调控基因的表达。研究发现miRNA-204靶向抑制ATF2的表达，进而抑制NSCLC增殖、迁移、侵袭［25-28］。miRNA-204-3p 还可靶向乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDHA）介导的糖酵解负向调控膀胱癌细胞的增殖［29］。经Targetscan 数据库进行生物信息学分析，EphB2基因作为miR-204-3p的候选靶基因，EphB 作为受体络氨酸蛋白激酶之一，在肿瘤发生发展中发挥重要作用［29］。Hagen等［30］研究发现EphB2是胃癌患者是独立预后标志物，具有促进肿瘤细胞侵袭性作用。Megiorni等［31］研究也表明，EphB2 在横纹肌肉瘤中表达异常升高［31］。Wang 等［32］研究发现，EphB2 参与细胞平滑肌细胞向毛细淋巴管的异常迁移。Salgia［33］的研究也表明EphB 的表达失调与肿瘤的生长、转移相关。在本研究中，EphB2 作为致癌因子，过表达促进NSCLC 增殖、侵袭及转移，抑制细胞凋亡。miR-204-3p 在NSCLC 中下游的调控机制尚不清楚，为探究miR-204-3p 与EphB2 之间是否存在靶向关系，我们通过双荧光素酶报告以及qPCR 和WB 检测均表明在NSCLC 中，miR-204-3p 能够靶向结合并抑制EphB2 的表达。其中miR-204-3p表达与EphB2 表达呈负相关，通过过表达EphB2后能挽救miR-204-3p 高表达所抑制NSCLC 增殖、侵袭、迁移能力及细胞凋亡。因此，mir-204-3p/EphB2是NSCLC 进展的重要调控机制之一，EphB2高表达是NSCLC 不良预后的标志分子，

本研究存在的不足，仅在体外细胞内验证这一机制，需在动物模型体内进一步验证该机制，并且深入探究mir-204-3p 上游调控机制，可进一步的完善NSCLC 发生进展的机制，有望为临床上靶向治疗提供了新的依据。