INI1诱导上皮样肉瘤细胞向脂肪方向分化

谢显彪，温丽丽，吕东明，邹雨桐，姚 浩，彭挺生

（1.中山大学附属第一医院骨肿瘤科，广东广州 510080；2.广东省骨科学重点实验室，广东广州 510080；3.中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州 510060；4.中山大学附属第一医院病理科，广东广州 510080）

上皮样肉瘤是一种好发于青少年四肢及躯干的软组织恶性肿瘤。本病组织来源不明，现多认为其起源于原始间叶细胞，肿瘤细胞具备向上皮及间叶方向分化能力，同时表达上皮标志物如细胞角蛋白（cytokeratin）、上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）及间叶标志物如波形蛋白（vimentin）。临床上该肿瘤表现为皮下或深部软组织缓慢生长的无痛性肿块，易通过淋巴道及血道转移，切除后易复发，预后较差。目前手术是该病主要治疗手段，患者五年生存率仅为60%～75%，复发率29%～85%，局部淋巴结转移率22%～48%，远处转移率27%～62.5%，肺是最常见远处转移部位［1-2］。近年来研究者们发现约90%上皮样肉瘤中存在特征性的整合酶相互作用分子1（integraseinteractor 1，INI1）表达缺失现象［3-4］，然而INI1 在上皮样肉瘤中的作用及分子机制尚未阐明。因此，本研究主要是进一步探讨INI1 在上皮样肉瘤中的作用及分子机制，为治疗上皮样肉瘤提供相应理论基础及实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

DMEM 培养基、2.5 g/L 胰酶、胎牛血清、青霉素和链霉素双抗溶液、四甲基偶氮唑盐（MTT）（广州天骏生物科技有限公司，货号：C11995、03-050-1A、10270-106、03-034-1B、A056），pTet-tTS质粒（Clontech 公司），强力霉素（doxycycline，Dox）购于江苏艾康生物医药研发有限公司（货号：M40613-5g），RIPA 裂解液、DMSO（广州恒研生物科技有限公司，货号：RIPA-EA0002、DMSO-1084ML100），INI1 抗体、Cytokeratin 抗体、Vimentin抗体、Leptin 抗体、Adiponectin 抗体、LPL 抗体、PPAR-γ抗体、CEBP-α抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗（上海艾博抗生物科技有限公司，货号：ab192864、ab756、ab92547、ab3583、ab133347、ab21356、ab45036、ab40764、ab6728），β-actin（CST公司，货号：4970）。

1.2 细胞株与细胞培养

上皮样肉瘤细胞株VA-ES-BJ、上皮恶性肿瘤细胞株A549 及MDA231、其他间质肉瘤细胞株MFH 及SK-LMS、正常细胞NHDF 及HC-SMC 均购于ATCC，在含有100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养液中，置于37 ℃及体积分数5%CO2下培养，2～3 d 传代1 次。

1.3 MTT 法检测细胞增殖速度

取对数生长期的细胞，经胰酶消化制成单细胞悬液并计数，吹匀细胞，接种于96 孔板中，每组设3 个复孔，接种密度1×104个/孔。接种后24 h 分别更换成含Dox 1 mg/mL 及0 mg/mL 的培养基，连续7 d 进行测定，加入20 μL 的5 g/L MTT 溶液后培养4 h。弃去培养液，加入100 μL DMSO，待结晶完全溶解后，在Bio-Rad550 酶联免疫检测仪测定吸光度，绘制增殖曲线。

1.4 蛋白印迹法

将107个细胞收集于预冷的EP 管中，向EP 管中加入0.2 mL 的裂解缓冲液（7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF）后反复吹打直至细胞完全裂解；室温静置30 min，4℃，15 000×g离心60 min，取上清即为总蛋白质。按照碧云天的试剂盒说明书抽提细胞浆蛋白。进行SDS 电泳后电转移至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。1∶1 000一抗4 ℃孵育过夜。1∶5 000 二抗室温孵育1 h，最后加入化学发光剂进行检测，X 线片暗室曝光，常规显影定影。使用Image J 软件进行目标蛋白相对表达水平的分析。

1.5 石蜡切片免疫组化

将组织切片脱蜡并水化；加入EDTA 修复液于微波中档修复10 min；加入3%的过氧化氢灭活；加入5%正常血清37℃封闭30 min；加入一抗（1∶200）4 ℃湿盒孵育过夜，PBS 冲洗3 次，每次3 min；滴加辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育30 min；滴加新鲜配制的DAB 显色液10 min，水洗；苏木素复染1 min，水洗后用1%的盐酸酒精分化，水洗；脱水固定，滴加中性树脂，加盖玻片，自然晾干，在显微镜下观察并采集图像。染色结果判读标准，把染色肿瘤细胞强度分为0、1、2、3 四类，分别为无、弱、中、强信号。把染色肿瘤细胞百分比分为0、1、2、3、4 五级，分别对应无染色、1%～10%、11%～50%、51%～80%及81%～100%。每个组织的得分是用染色值乘以百分比分类值来计算的，最后得分取两位病理学家双盲阅片下的平均分，阳性等级：0 分为阴性，1～4 分为弱阳性，5～8 分为阳性，9～12 分为强阳性。

1.6 油红染色

细胞爬片，用10%中性甲醛固定30 min，60%异丙醇浸洗，0.5%油红O 60 ℃染色8 min，85%异丙醇洗3 min，蒸馏水洗，Mayer 苏木素复染，水洗并甘油明胶封片，倒置显微镜下拍片。

1.7 INI1 Tet-on 诱导表达建立

将pTet-tTS 质粒以脂质体法转染VA-ES-BJ细胞，通过G418 筛选细胞克隆。以双萤光素酶报告基因检测系统筛选挑选高表达低背景的严密型Tet-on 细胞克隆。共转染PBI-EGFP-INI1-HA/PTK-Hyg，通过潮霉素B 筛选并鉴定相关克隆。加入Dox 1 mg/mL 培养基培养后收集细胞提取蛋白做INI1 蛋白表达鉴定，同时取部分细胞于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP 的表达情况，鉴定出高表达低背景的细胞克隆扩增冻存。

1.8 统计学处理

统计学分析使用SPSS 21.0 软件，图形绘制使用GraphPad Prism 8.0。每组实验重复3 次，数据用均数±标准差描述；两组间比较，各组数据呈正态分布且方差齐时用t检验；若呈正态分布但方差不齐时则采用秩和检验。多组计量资料数据比较，符合正态分布及方差齐性的用one-way ANOVA 分析方法；组间两两比较用Tukey 检验。检验水准α=0.05（双侧），P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 INI1 在上皮样肉瘤中表达缺失

通过Western blot 检测正常细胞间叶细胞-成纤维细胞NHDF 及平滑肌细胞HC-SMC，上皮来源性恶性肿瘤-肺癌细胞株A549 及乳腺癌细胞株MDA231，上皮样肉瘤细胞株VAESBJ 及Epi544，其他间质来源恶性肿瘤-恶性纤维组织细胞瘤细胞株MFH 及平滑肌肉瘤细胞株SK-LMS，我们发现正常细胞株、上皮来源恶性肿瘤细胞株及其他间质来源的肉瘤细胞株中均存在INI1 表达，仅仅在上皮样肉瘤细胞株VA-ES-BJ、Epi544 中存在INI1 表达缺失的现象（P<0.05；图1A）。免疫组化检测上皮样肉瘤临床标本发现91%标本中存在INI1 蛋白表达缺失（图1B）。

2.2 利用Tet-on 系统重建VA-ES-BJ 细胞中INI1 表达

首先转染pTet-tTS 质粒建立Tet-on 细胞，最后转染PBI-EGFP-INI1-HA/PTK-Hyg，通过潮霉素B 筛选并鉴定稳定转染INI1 克隆，获得5 及21号克隆细胞。在细胞培养液加入Dox 1mg/ml 诱导后，可见5、21 号克隆细胞中INI1 表达显著上调，而对照组INI1 表达仍为缺失（P<0.05；图2）。倒置荧光显微镜下可以观察到Dox 1mg/mL 诱导后5、21号克隆细胞中出现明显的绿色荧光（图2）。

2.3 重建INI1 表达诱导VA-ES-BJ 细胞向脂肪方向分化

在加入Dox 诱导INI1 持续表达7 d 后，在普通倒置显微镜下发现细胞形态发生改变，胞浆逐步丰富变，胞浆中出现大量空泡，细胞增殖速度明显抑制（P<0.05，图3A、B），同时上皮细胞标记分子Cytokeratin 明显下调，间质细胞标记分子Vimentin依然大量表达（P<0.05；图3C），进一步检测脂肪细胞相关标记物，发现瘦蛋白（Leptin）、脂联素（adiponectin）和脂蛋白酯酶（lipoprotein，LPL）表达上调（P<0.05；图3D）。这些结果提示重建INI1 表达可诱导上皮样肉瘤细胞向脂肪方向分化。

2.4 重建INI1 诱导的VA-ES-BJ 细胞中脂肪形成转录因子的表达上调

图1 INI1 在上皮样肉瘤中的表达情况Fig.1 Expression of INI1 in epithelioid sarcoma

图2 重建VA-ES-BJ 细胞中的INI1 表达Fig.2 Reconstruction of INI1 expression in VA-ES-BJ cells

我们进一步在VA-ES-BJ 细胞中检测脂肪分化过程中的两种脂肪分化过程中关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome prolif⁃erators-activated receptor-γ，PPAR-γ）及CCAAT 增强子结合蛋白-α（CCAATenhancer binding proteinα，CEBP-α）的蛋白表达水平。我们发现随着INI1诱导表达，PPAR-γ和CEBP-α表达均明显上调（P<0.05；图4A）。同时，重建INI1 后油红染色出现显著阳性（图4B）。上述结果表明INI1 可能通过上调脂肪分化中的关键转录因子PPAR-γ和CEBP-α来促进上皮样肉瘤细胞向脂肪方向分化。

3 讨论

图3 重建INI1 诱导VA-ES-BJ 细胞向脂肪方向分化的影响Fig.3 Reconstruction of INI1 induces adipocytic differentiation of VA-ES-BJ

本研究证实在上皮样肉瘤细胞VA-ES-BJ 及Epi544 中INI1 蛋白表达缺失，在临床标本中91%存在INI1 蛋白表达缺失，与既往报道的基本一致。Hornick［5］等报道临床上约90%上皮样肉瘤中存在INI1 缺失现象。INI1 是ATP 依赖的染色质重塑复合物SWI/SNF（switch/sucrose non-ferment⁃able）的核心蛋白亚基之一。SWI/SNF 复合物是一种进化保守的多亚单位蛋白复合物，它能够利用ATP 水解产生能量动员核小体，通过滑动、重建、分离、置换等作用介导染色质解压缩、重塑，从而调节靶基因转录，这种基因表达调解方式是表观遗传学重要调控机制之一［6-7］。INI1缺失可严重影响SWI/SNF 复合物活性，染色质重塑异常，导致基因表达失控［8-9］。INI1 纯合性缺失的小鼠在胚胎早期死亡，杂合性缺失小鼠中约20%在12 个月左右形成低分化或未分化软组织肉瘤，这些肿瘤侵袭性极强，75%发生淋巴结或肺转移［10］。Brenca等［11］证明上皮样肉瘤细胞系VASEBJ 中INI1 表达的缺失是由于外显子1 突变导致INI1 纯合缺失所致，INI1 的重建导致细胞增殖和细胞迁移减少，并增加了对遗传毒性应激的敏感性。而Imura 等［12］发现AKT/mTOR 信号通路在两个INI1 缺失的细胞系VAESBJ 和Asra-EPS 中持续激活，通过干扰mTOR 可以抑制肿瘤细胞的增殖。由此可见，INI1在肿瘤发生过程中起到重要的抑癌作用。INI1 的缺失通过对基因组稳定性、细胞周期调控及其他信号通路相关靶基因的异常调控导致肿瘤转化［13］。由此可见，INI1 在上皮样肉瘤发病中具有重要作用。

图4 INI1 上调脂肪形成转录因子的表达Fig.4 INI1 up-regulates expression of adipogenic transcription factors

鉴于INI1 的抑癌功能，本研究通过Tet-on 系统在上皮样肉瘤细胞中重建INI1 表达。最新研究发现INI1 在胚胎发育和细胞分化中扮演重要角色。Gresh 等［14］采用肝脏特异性INI1 敲除动物模型发现70%与正常肝脏发育相关的基因下调，表明INI1 与肝细胞分化密切相关。在鼠3T3-L1 脂肪前体细胞及人间充质干细胞中，干扰INI1 表达可抑制其向脂肪及神经细胞方向分化［15］，鼠PC12细胞中干扰INI1 表达可抑制神经生长因子诱导的神经细胞向分化［16］。诱导表达INI1 后我们发现胞浆丰富，胞浆中出现大量空泡，细胞增殖速度明显抑制，上皮细胞相关标志物Cytokeratin 消失，脂肪细胞相关标记物如瘦蛋白、脂联素、脂蛋白脂酶表达上调，同时油红染色出现特征性阳性，提示肿瘤细胞出现向脂肪方向分化。

既往有研究报道，棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞分化都需要转录因子PPAR-γ和CEBP-α，它们在细胞向脂肪方向分化中起到关键作用［17-18］。脂肪生成刺激信号通过激活PPAR-γ诱导前脂肪细胞终末分化，随后PPAR-γ和CEBP-α协同调控下游脂肪细胞相关基因的表达［19］。特异性靶向抑制PPAR-γ基因可促进人骨髓基质干细胞向成骨分化，同时抑制其成脂防分化［20］。最新研究报道PPAR-γ激动剂吡格列酮和曲贝替定的联用能促进粘液样脂肪肉瘤的终末脂肪分化［21］。本研究在上皮样肉瘤细胞中重建INI1 后发现细胞向脂肪方向分化，伴随PPAR-γ和CEBP-α的上调，表明INI1 可能通过上调PPAR-γ和CEBP-α的表达，促使上皮样肉瘤细胞向脂肪方向分化，刺激并维持脂肪细胞的表型。

综上所述，上皮样肉瘤组织起源于原始间叶细胞，同时具备上皮及间叶方向分化能力，肿瘤细胞中INI1 蛋白表达缺失。在上皮样肉瘤细胞中重建INI1 表达，通过上调转录因子PPAR-γ和CEBP-α表达，诱导其向脂肪方向分化，为该肿瘤提供了诱导分化治疗的潜在靶点。