洋葱组织培养及遗传转化研究进展
2020-10-12惠林冲李威亚杨海峰何林玉郇国磊王江英徐卫平李景芳缪美华陈振泰潘美红
惠林冲,陈 微,李威亚,杨海峰,何林玉,郇国磊,王江英,徐卫平,李景芳,缪美华,陈振泰,潘美红*
(1.连云港市农业科学院,江苏 连云港 222000;2.江苏省云台农场有限公司,江苏 连云港 222000)
洋葱(AlliumcepaL.)是重要园艺蔬菜之一,已有4000多年的栽培历史,被世界各地广泛栽培[1]。洋葱遗传背景复杂,单株自交系统选育纯合的种质资源困难,同时洋葱是二年生植物,选育周期长;杂种优势明显,生产中以洋葱细胞质雄性不育(CMS,cytoplasmic male sterility)系选育杂交种,国内外已开发出筛选不育系的分子标记cob[2]、orfA501[3]、Cpp1[4]和orf725[5],筛选保持系的分子标记jnurf13[6]、AcSKP1[7]、DNF-566、RNS-357[8]、OPT和PsaO[9],加速了洋葱杂交育种的选育进程。针对市场和育种方向需求,急需选育既有优良农艺性状和商品性状,同时又抗逆的亲本材料,这通过常规育种手段难以实现。组织培养技术和现代分子技术的应用,促进了植物育种发展,尤其是转基因和基因编辑技术成熟。目前在洋葱转基因技术研究中,已有报道将抗草甘膦和膦环素的除草剂基因转入洋葱材料中,但转化频率最高为0.9%[10],转基因技术应用于洋葱的突破性进展仍显不足;另外,基因编辑(genome editing)是对生物体基因组进行靶向修饰的一项新技术。该技术利用核酸酶在特定位置产生的双链DNA 损伤,通过非同源末端连接和同源重组修复机制,实现在特异目标位置DNA 的插入、删除或特定DNA 片段的替换[11]。利用CRISPR/Cas9 系统分别在双子叶植物拟南芥[12]、烟草及单子叶植物水稻[13]和小麦[14]中成功实现了对内源靶基因的定点编辑。在洋葱中还未见相关报道,其中构建CRISPR/Cas9载体系统技术相对成熟,但与转基因技术一样,关键基础核心技术是农杆菌介导转入洋葱愈伤成苗体系的建立,大部分研究依然集中在愈伤遗传转化效率这个核心问题,利用转基因或基因编辑新技术选育新品种还有一定的距离。笔者针对国内外洋葱组织培养和遗传转化的研究进行了综述,对洋葱组织培养的外植体材料、愈伤组织诱导、植株再生及生根的配方进行了探讨,同时对基因编辑技术在洋葱中应用提出了研究方向。
1 洋葱愈伤组织诱导的研究
1.1 洋葱愈伤组织诱导的外植体类型
国内外科研人员对洋葱的愈伤诱导的技术已非常成熟,但因不同的基因型、不同外植体材料的原因,洋葱愈伤组织的诱导率各不同,建立高效的诱导愈伤组织体系至关重要。目前洋葱外植体选择主要有种子,种子萌发的胚芽、茎尖、根尖,鳞茎盘、花蕾、试管苗叶片和幼嫩花序等(表1)。分析37份文献报道,葱属材料愈伤组织诱导培养基中利用种子作为外植体占60%,其中一部分是种子消毒后,在培养基上培养24 h,剥离成熟胚(21%)、胚根(7%)、根尖(10%)、幼苗茎尖(16%),另一部分直接将种子放入培养基上诱导(10%);利用洋葱球底部的鳞茎盘为外植体占16%,而利用顶部幼嫩花序、未成熟胚和叶片作为外植体的较少(2%),叶片接种后逐渐玻璃化,很难诱导出愈伤[15];其他外植体均能诱导出愈伤组织。外植体使用频率较高的是种子中成熟胚、幼苗茎尖,鳞茎盘和花蕾。
表1 洋葱不同外植体愈伤组织诱导
虽然洋葱种子取材方便,不受季节、时间限制,然而在操作上需要无菌操作,且先预培养,切开种子取胚、胚根等,然后转移到另一个培养基中,劳动强度大,技术要求高,容易污染。鳞茎盘和花蕾操作上比较方便,从本课题组操作经验看鳞茎盘比较方便,尤其是洋葱球的鳞茎盘,容易消毒,取样方便,数量多,污染率较低;而花蕾尽管取样方便、数量多,但污染率较高,花期短,花蕾取样大小不容易控制。洋葱种球存储达4个月以上,鳞茎盘外植体要优于花蕾外植体[39]。值得注意的是花蕾作为外植体未经过愈伤组织可以直接诱导多个芽结构[36,52]。洋葱幼嫩花序作为外植体很少有研究,与花蕾一样取样周期短,但王建军等研究发现其愈伤诱导率达100%[38]。本课题组也利用22份洋葱资源的花序进行愈伤诱导,诱导率为100%,且污染率低,取样方便,数量多。
1.2 洋葱愈伤诱导的品种基因型
洋葱愈伤诱导中基因型的选择非常重要,有的能够直接诱导出愈伤,有的不能直接诱导出。对12个葱属植物进行愈伤诱导发现,有些品种从胚胎发生的愈伤组织培养中再生出芽,有些尽管诱导出愈伤但在光照下无绿色组织形成[21]。洋葱品种780愈伤诱导明显优于其他两个品种N-2-4-1、Hisar-2[31];不同洋葱基因型能够诱导出愈伤,但诱导率也存在明显的差异,对8个不同基因型研究发现,最高出愈率为84.0%, 最低为42.8 %[32];在研究的16个品种中,愈伤组织诱导率最低为50.5%[44]。Zhang等对洋葱的13个处理中,以atm24品种为最优,总的再生率为4.62%[24]],说明不同外植体愈伤组织和再生芽存在显著的基因型差异,高度依赖于所使用的品系。
1.3 洋葱愈伤组织诱导的培养基及培养条件
培养基的配方是组织培养重要的成分,通过提供必要的营养物质来调节植物组织的生长和形态。MS、B5和BDS是在洋葱愈伤组织诱导中常使用的基础培养基。BDS培养基是Dunstan等在添加了铵、磷和氮的改良B5培养基。研究发现以BDS为基础培养基,洋葱愈伤组织的鲜重比B5增加了40倍[17]。以洋葱、水稻、玉米、大豆、棉花、烟草、覆盆子和非洲菊为试验材料,对愈伤组织生长、植株再生、微繁殖率、毛状根生长和次生代谢产物比较发现BDS的培养效果与MS或B5相同或更好[37]。以B5为基础培养基比较少,主要集中在1970~1980年,1995年至今大部分以MS为基础培养基,在MS培养基上诱导和继代培养的愈伤组织再生时产生的芽和根明显多于在BDS培养基上继代培养的愈伤组织[24]。目前,MS已经商品化,购买渠道和操作方便、生产批次和配方稳定(表1)。部分研究报道在MS的基础上添加了B5所含有的维生素[43,45],优化了洋葱愈伤所需的营养成分。
应用于洋葱愈伤组织诱导的激素主要有2,4-D、激动素KT(KT)、PIC(Picloram)、BA(benzylaminopurine)、2iP[6-(3-methyl-2-buten-l-ylamino)-purine]等,使用最多的是2,4-D,使用的浓度范围在0.1~4.0 mg/L,因基因型的差异,大部分筛选的最佳浓度是1 mg/L或2 mg/L 2,4-D(表1)。Zheng等研究发现洋葱愈伤组织的诱导和再生在很大程度上取决于2,4-D的浓度,而品种、蔗糖浓度和培养基类型则不那么重要[24]。洋葱品种Stuttgarter Giant在含有2.5 μmol/L 2,4-D 的B5上获得了坚硬、稻草色、球形、外观鲜艳的愈伤组织;当2,4-D的浓度降低至1.25 μmol/L时并没有导致愈伤鲜重和干重的减少[19]。KHAR等研究认为MS添加0.5 mg/L 2,4-D最有利于茎尖、根尖和种子的愈伤组织形成,2,4-D浓度的降低或增加导致愈伤组织形成的减少,2,4-D浓度超过一定水平会抑制愈伤组织的再生或导致形态形成能力的丧失和核型不稳定[31]。当NAA浓度大于0.05 mg/L时,愈伤生长受限。但是当0.05 mg/L NAA与0.14 mg/L 2,4-D结合时,愈伤组织的生长速度与在0.28 mg/L 2,4-D的培养基中相同,只有先在NAA/2,4-D组合上启动了胚根愈伤组织时,才会产生芽[20]。
PIC(Picloram)已被有效地用作可长期再生洋葱组织培养的生长素来源,在胚性愈伤诱导及植株再生方面优于2,4-D。同一洋葱品种的不同外植体使用Picloram诱导愈伤组织所需的浓度也不一样,茎尖和根(0.5 mg/L)和种子(1.0 mg/L)诱导愈伤组织形成,当Picloram浓度从1~5 mg/L增加反而导致愈伤组织诱导频率显著降低。培养基中BA和TDZ促进了洋葱深绿色愈伤组织的形成,但BA未诱导芽的形成[31]。不同浓度的蔗糖(10、20和30 g/L)对洋葱和青葱的愈伤组织诱导和植株再生没有显著影响[24]。培养基中添加酪蛋白水解物可提高愈伤组织的诱导频率,而添加谷氨酰胺无明显影响[31]。
洋葱愈伤组织诱导培养条件中,温度均在24~26 ℃,而培养的光照条件各不相同,有黑暗和光照两种,且均能诱导出愈伤组织,但黑暗的培养条件较多(表1)。
1.4 洋葱愈伤组织的类型及继代培养
洋葱(单子叶)愈伤组织通常有胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。而在洋葱愈伤组织诱导中出现两种不同类型:水性易碎型和干燥紧密型(图1)。水性易碎型:呈水状、透明状,无明显结构,由细长的管状空泡化细胞组成,细胞间联系松散,并由一个薄的分生组织带引导。干燥紧密型:表面干燥,有广泛的分生组织区,而在愈伤组织中心形成较大的空泡型薄壁细胞,由小细胞组成,细胞质致密,原皮发育良好[25]。区分胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织:胚性愈伤组织是脆性愈伤组织,而非胚性愈伤组织含有大量水分[34];胚性愈伤组织通常是致密的和结节状的,在显微镜下观察可与非胚性愈伤组织区分开[21];胚性愈伤组织的扫描电镜(SEM)分析显示,胚性愈伤组织有球形、鳞状和杆状[44]。紧凑型愈伤组织比水性愈伤组织具有更好的再生能力,胚胎具有明显的茎和根分生组织[21,24],适合作为洋葱胚性愈伤组织再生体系加以研究,而水性易碎型适合作为洋葱液体悬浮培养或原生质体的制备。
图1 洋葱干燥紧密型(A)和水性易碎型(B)愈伤组织
为获得更多的胚性愈伤组织,Tiwari等将胚性愈伤组织移入液体培养基中,实现了胚性愈伤的快速生长悬浮培养,所获得的球状胚性愈伤组织大量再生。用等体积的新鲜培养基代替老培养基,每15 d传代一次,植株再生频率高且表型正常[35]。酪蛋白水解物能显著改善愈伤组织类型,在显微镜下观察发现奶黄色愈伤组织易于形成胚性悬浮液[19,31]。低浓度的6-BA在继代培养基中可以促进胚性愈伤组织的形成。添加2.0 mg/L甘氨酸、690 mg/L脯氨酸和1.0 mg/L酪蛋白水解物也增加了愈伤组织诱导和胚性愈伤组织形成的频率[40]。20 g/L蔗糖和硫胺素(VB1)也能促进体细胞胚的成熟,当正常MS培养基中VB1浓度由0.1 mg/L增加到10 mg/L时,体胚发芽率达到93.3%[42]。
洋葱愈伤组织长期的继代培养染色体会发生变异和再生频率的降低。Daveya等利用洋葱愈伤组织含硫风味物质,但无论是未分化的愈伤组织还是生根的愈伤组织都不能产生大量洋葱特有的成分[17]。Selby等对3个洋葱品种20个独立的愈伤进行了9代继代培养,筛选高产蒜氨酸酶的变异株,结果显示蒜氨酸酶活性与正常植株相当,未筛选出能产生高水平洋葱风味化合物的愈伤[18]。在继代培养对洋葱再生频率影响方面,少于3个月的继代培养愈伤组织材料具有很高的再生潜力,大多数(97%)的再生植株具有正常的二倍体核型(2n=16),但非整倍体细胞数量随年龄的增加而增加[27,29,33]。
1.5 洋葱愈伤的液体悬浮培养
洋葱愈伤组织在液体培养基中悬浮培养能够大量、快速扩繁愈伤,且减少污染和人工继代培养的工序。鳞茎盘外植体在B5固体培养基上5~6周形成愈伤组织,在液体培养基中需要2~3周,液体培养基悬浮培养比固体培养基培养愈伤组织要快。液体培养中的愈伤组织可在1周内形成根,但在液体培养中未观察到芽或胚的形成[16]。愈伤组织培养中用于细胞悬浮起始的基因型是实现植物高效再生的关键。通常生长缓慢、坚硬、致密的愈伤组织,不适于液体悬浮,一般选用水性易碎型的愈伤组织,但此类型的愈伤组织再生频率比较低。2~3周龄的供体愈伤组织是原生质体分离的最佳材料,且愈伤组织的表型也很重要:愈伤组织生长越快,越易碎,就越容易适应细胞悬浮。可以通过细网孔筛选小细胞聚集物,缩短继代培养次数(2周)。原生质体需要复杂的有机培养基来再生细胞壁,优化培养基的渗透压和透气性以保持细胞膜的完整性和快速扩繁[53]。液体培养基与固体培养基在植物再生方面的差异不大,但经过较长时间的离体培养后,芽再生速度明显下降[27]。为解决悬浮液愈伤的不良增殖的问题,Zhang等通过反复的光/暗过渡建立了稳定的悬浮培养体系[29]。Wu等建立3 L圆球型生物反应器,接种密度为5 g/L和0.1 m3/min空气体积,最有利于洋葱胚性愈伤组织的增殖[42]。同时,液体悬浮培养还将有利于转基因和基因编辑技术中农杆菌的侵染和共培养研究。
2 洋葱愈伤组织再生体系的建立
对洋葱愈伤组织的再生过程进行组织学观察,发现在愈伤组织表面形成胚状结构,从球形胚发展到两极胚的茎和根尖,与维管束相连发育成小植株。另一方面,异常的、高水化的外观结构并没有发育成芽或幼苗,植株的再生是通过体细胞胚形成的[30]。在已报道的30份洋葱再生最佳培养基中,除了7份使用B5或BDS基础培养基,其他23份都以MS为基础培养基,其中有4份配方无任何激素,也能诱导愈伤再生(表2)。Fridboro等认为细胞分裂素对于生长和器官形成不是必需的,但会轻微刺激叶状芽的形成,NAA或IAA刺激了愈伤组织生长和根部形成[16]。洋葱愈伤组织在NAA培养基上只分化出多种形态和结构的根,未分化出芽[17]。而Dunstan等研究发现胚根在含有NAA/2,4-D激素组合的培养基上诱导的愈伤组织,在再生培养基上才会产生芽,5周的愈伤组织会产生更大比例的芽和绿色结节区域,产生的芽不具有绿色幼苗的习性,经常表现出末端两裂的叶片,叶片变厚,外观光滑[20]。在含有5.37 mmol/L NAA和4.65 mmol/L KT两种激素组合的MS液体培养基中,培养2周后,发现芽原体,形成芽和根[33]。
表2 洋葱愈伤组织再生体系诱导
ABA促进体细胞胚的发育和萌发,在MSK培养基中1 μmol/L ABA使两个洋葱品种的平均芽密度显著增加,芽密度增加是由于每个基因型产生芽的愈伤组织的数目增加。长时间的愈伤组织继代培养后,形成体细胞胚和植株的能力下降[21]。王建军等利用幼嫩花序诱导的愈伤组织在添加1.0 mg/L TDZ的B5培养基上再生芽分化率达78.13%[38]。Sivanesan等在MS培养基中添加1.0 mg/L 2,4-D,植株再生频率最高达70.1%,其次是picloram(38.9%)和2,4-D + picloram(34.5%)[44]。
通过对不同类型和浓度的细胞分裂素(BA、TDZ、ZR和ZT)与不含生长调节剂的培养基研究发现,愈伤组织只有0.25%~0.88%产生芽,对洋葱幼苗的再生没有促进作用。反而细胞分裂素浓度的增加导致了根的减少[27]。在分蘖洋葱中也发现随着6-BA浓度的升高,分化率下降[40],但激动素增加到10 mg/L对洋葱再生无任何影响[31]。在再生培养基中添加BAP并没有增强愈伤组织细胞或悬浮细胞簇的芽再生,BAP的存在显著促进了绿色愈伤组织在培养基上的诱导和生长[30]。另外在再生培养基中添加2.0 mg/L甘氨酸可促进再生频率升高(78.1%)和植株形成(28.7株/愈伤组织)[40]。愈伤组织从诱导培养基转入再生培养基中,植物生长激素残留可能会对再生产生影响。活性炭(AC)可以吸收一些潜力无机离子、生长激素和酚醛树脂,因此,将AC加入再生培养基可增加植株再生频率[44]。近几年,Wu等研究发现能够在无激素的MS培养基上建立洋葱高频再生体系[42]。本课题组通过几年的基因型筛选,在无激素的MS培养基诱导出苗,愈伤组织新长出绿色组织,而不是愈伤组织变绿,并逐步分化出芽结构(图2A、图2B),但再生频率较低。所以,葱属植物的再生高度依赖于特定基因型和胚性愈伤组织的培养周期[24-25]。
图2 洋葱愈伤组织诱导再生苗
洋葱愈伤组织诱导成苗后,在添加高浓度NAA(1.5 mg/L)的培养基上, 愈伤组织生成大量根, 不产生芽;而在低浓度NAA(0.5 mg/L)培养基上, 芽大量发生, 基本不生成根[32]。在不添加任何生长调节剂的情况下将幼苗移入1/2MS或MS培养基中,可以很容易地诱导其生根[25,31]。各基因型间根的形成能力在不同培养基间差异不显著。本课题组在诱导愈伤组织再生苗的过程中,当幼苗长出2~4片管状叶后,根也会生长出来,无需转移到生根培养基中(图2C、图2D)。
3 洋葱愈伤遗传转化系体研究
研究洋葱遗传转化的报道比较少,主要通过根农杆菌LBA4404(pTOK233)和EHA105(pCAMBIA1301)侵染愈伤组织进行筛选。转化基因主要有uidA、UGS、GFP、抗除草剂、抑制催泪因子基因及转花青素基因等(表4)。影响遗传转化的重要因素除了愈伤组织再生体系外,还有材料、共培养期、共培养培养基和选择培养基等。
表4 洋葱遗传转化研究成果
不同品种间GUS基因表达水平存在差异。Ashwini发现洋葱品种CO3的GUS基因表达水平低于Bellary[45]。Zheng等[47]利用农杆菌介导β-glucuronidaseuidA基因和GUS基因表达转化洋葱和大葱,发现大葱优于洋葱;共获得83株转基因植株,植株形态和染色体数目均正常;在1个转基因洋葱株系中也发现了基因沉默,GUS在叶片中有表达,而在鳞茎中几乎没有表达;而不同农杆菌品系、愈伤组织年龄、愈伤组织来源和渗透处理对共培养转化效率没有影响。转基因的频率非常低,Pablo等对gus a和nptII的特异性引物PCR分析仅获得1株转基因洋葱[50]。
由于不同的植物和组织对不同的选择剂的反应不同,因此需要大量的选择剂。Eady等研究了抗生素、卡那霉素、潮霉素、新霉素(Geneticin)和除草剂草铵膦作为洋葱组织培养的选择性药剂。卡那霉素不适合洋葱生长,而草铵膦、新霉素和潮霉素则明显抑制了洋葱的生长。低水平的潮霉素(10~30 mg/L)降低了愈伤组织的生长,但显著增加了胚性愈伤的再生频率[54];而Mythili等认为转基因洋葱中新霉素(Geneticin)是一种较好的选择试剂[55]。减小愈伤组织的大小,从而增加对选择剂的接触面积,显著提高了筛选效率[47]。
田间杂草影响洋葱的生长和产量,目前还未有较好的除草剂应用于洋葱田除草。已有报道将抗草甘膦和膦环素的除草剂基因转入洋葱材料中,用两倍剂量的除草剂喷施,对转基因洋葱无影响,但转化频率最高为0.9%[10]。首次报道甘露糖作为洋葱的筛选指标,开发了一种不需要使用抗生素或除草剂的洋葱转化筛选系统。该系统使用了大肠杆菌基因编码磷甘醇异构酶(pmi)。转基因植物携带编码pmi的manA基因,可以通过pmi活性将6-磷酸甘露糖转化为果糖-6-磷酸解毒。果糖-6-磷酸是糖酵解的中间产物。利用农杆菌和生物系统,分别以27%和23%的转化率培育出转基因植株[49]。利用农杆菌介导的愈伤组织进行RNAi抑制催泪因子基因(LFS)表达,获得了4株转基因株系,但在4个转基因之间LFS酶活性和LFS蛋白有差异,可能是由于RNAi介导沉默的多样性造成的[51]。Zheng等利用编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的基因(Bt)开发的cry1Ca和H04转基因青葱(shallots:AlliumcepaL.),可有效对(亚)热带青葱甜菜夜蛾产生抗性[48]。谭武平利用基因枪和农杆菌两种方法将含花青素合成转录因子基因转入洋葱表皮,部分细胞变成紫色,同时该转基因植株的鳞茎有花青素的积累,开发了花青素作为一种可视化跟踪系统用于洋葱转基因植株早期筛选的方法[41]。
4 展望
目前已有报道建立了洋葱完整的遗传转化体系,但转化效率低,制约了洋葱重要功能基因的验证与应用。在很大程度上受限于基因型的材料,洋葱愈伤组织诱导培养基的配方、培养条件均影响不大,但再生频率低,制约了洋葱转基因和基因编辑技术的应用。综合前人研究进展及本课题组的经验,提出以下合理优化方案,以解决洋葱愈伤诱导、植株再生及遗传转化的问题。第一:愈伤组织诱导是关键的第一步,因课题组洋葱资源圃材料(中日照类型)多,选择性强、方便,采用单一变量控制法,利用洋葱幼嫩花序为外植体,作为变量因素,培养基配方固定不变,目前已建立通用型愈伤组织诱导方法,避免了因基因型的差异,设计多种配方的麻烦。第二:在愈伤组织再生苗诱导方面,曾采用常规方法对单一品种的愈伤设计激素浓度组合,大量组合均未诱导出苗;后采用无激素的MS培养基固定不变,对多种基因型的愈伤组织进行诱导,成功筛选出容易诱导出苗的品种,尽管再生频率低,后期将对筛选出再生苗的品种进行不同激素组合试验,以进一步提高再生频率。第三:目前洋葱转基因和基因编辑技术的核心基础研究是遗传转化体系的建立,虽然愈伤组织再生频率低,但是愈伤组织非常容易诱导生根,可利用筛选出特定基因型的愈伤组织进行农杆菌侵染,优化侵染时间、共培养培养基、筛选剂,然后再诱导生根,在根中进行检测,能够提高工作效率。另外,如果将洋葱的一些优质基因、抗虫抗病基因分离和克隆出来,则将会极大地促进洋葱转基因和基因编辑技术的发展和应用。
表3 洋葱组织培养最佳生根诱导培养基