响应面法优化微波辅助提取节节草中的多糖

潘乐， 魏涛， 孙丽莉， 吴进， 刘华敏

（1.黄山学院 化学化工学院， 安徽 黄山245041； 2.安徽中烟工业有限责任公司技术中心， 安徽 合肥230088）

0 引言

节节草（Equisetum ramosissimumDesf.）为木贼科多年生草本植物，在《中国药典》2010 版中学名为木贼，其含有多糖、黄酮及生物碱等有机活性成分［1］. 已经报道证实其有清热解毒、降火清淤、降血脂、保护血管等作用，是一种极有前景的天然中草药［2］. 国内外学者对木贼科植物的有机活性成分进行了研究［3］. 天然多糖具有抗氧化、防衰老、降血压、降血脂及抗肿瘤等功效，因而受到了业界人士的广泛关注. 多糖主要来源于天然植物之中，现已知晓可以从贡菊［4］、南瓜［5］、筋骨草［6］等植物中提取多糖. 主要提取的方法有水热法、酶解法、超声波辅助提取、微波辅助提取、超临界流体萃取等提取方法［7］.

微波辅助提取法是一种新型高效的天然产物提取方法，相比于传统的热水浸取法，微波辅助提取具有耗时短、效率高、能耗少等优点. 已有报道微波可以提取板栗淀粉［8］、芒果片多酚［9］、艾叶总黄酮［10］等天然活性物质. 然而，现阶段还未见有微波辅助提取节节草中多糖的报道. 本实验研究采用高效的微波提取技术提取节节草中的多糖工艺. 实验在单因素试验的基础上，利用响应面法优化微波辅助提取节节草中的多糖，从而得到微波辅助提取的最优工艺.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2018 年9 月22 日通过“淘宝”购于皇冠店“亳州市九林中药材销售公司”，经黄山学院生命与环境科学学院吴永祥副教授鉴定为节节草样品. 将采购的样品放入烘箱中干燥后放入到中药粉碎机中粉碎，过筛（100 目）. 称取一定量的节节草粉末，按料液比为1∶20 的比例加入无水乙醇浸泡1 h 进行脱脂，然后将样品抽滤，烘干至恒重. 将粉末收集到广口瓶中密封保存，备用.

葡萄糖、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷为分析纯，购于国药集团化学试剂公司； 浓硫酸为分析纯，购于西陇化工股份有限公司； 苯酚为分析纯，购于宜兴市化学试剂有限公司； 水为超纯水. GZX－9030 MBE 电热鼓风干燥机，MAPADA UV－1100 紫外分光光度计，FA12048 电子分析天平，XH100B 微波催化合成萃取仪，XFB－1000 中药粉碎机，RE－52AA 旋转蒸发器.

1.2 节节草多糖含量的测定

移取1.00 mL 节节草多糖提取液于50 mL 烧杯中. 移取6 mL 去离子水于烧杯中进行稀释，搅拌均匀后移取多糖稀释液1.00 mL 于50 mL 具塞试管中. 按次序先后加入1 mL 5%苯酚和5 mL 浓硫酸，摇匀后置于水浴锅中，60 ℃水浴10 min. 待显色反应完成后，紫外分光光度计在波长为490 nm 处测试待测液体的吸光度值，该过程利用去离子水为参比溶液进行校零. 节节草多糖的提取按公式（1）计算：

式中：S为节节草多糖提取质量分数／（mg／g）；ω为溶液质量浓度／（mg／mL）；V为液体体积／mL；N为样品稀释倍数；m为节节草样品质量／g.

1.3 节节草多糖提取最优条件的确定

在单一变量的条件下分别研究提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1 ∶60 g／mL），微波时间（5、10、15、20、25 min），微波功率（200、300、400、500、600、700 W）对节节草多糖提取率的影响. 在单因素实验的基础上对节节草多糖提取率的3 个因素料液比、微波时间和微波功率进行编码. 通过Design－Expert 10 软件进行分析和优化.

1.4 红外光谱表征

将微波辅助提取得到的节节草多糖溶液加入到旋转蒸发仪中，加热浓缩至一定量后倒入分液漏斗中，按体积比为（1∶4）的比例加入Sevage 试剂，剧烈振荡后除去2 层液体中间物质，重复多次完成除蛋白. 按1∶1 的比例往除去蛋白质后的节节草多糖溶液加入无水乙醇，然后将样品液进行过滤后放入鼓风干燥箱烘干至恒重. 取少量处理后得到的节节草多糖，与干燥的溴化钾粉末混合，在玛瑙研钵中研磨均匀，压片后使用红外光谱仪扫描32 次，得到微波提取节节草多糖的红外光谱图.

2 结果与讨论

2.1 微波辅助提取条件的确定

预实验结果显示，对于微波辅助提取节节草中的多糖影响因素有料液比、微波温度、微波时间等. 对料液比、微波温度、微波时间分别进行单因素实验，获得最佳单因素提取条件为料液比1∶50 g／mL，提取时间15 min，温度60 ℃. 由于节节草多糖的提取会受到这些因素的相互影响，因此根据响应面优化方法，利用单因素实验的结果和Box－Benhnken 的中心组合设计原理［10］，确定节节草多糖提取工艺响应面分析的变量因素编码和水平如表1.

表1 响应面分析因素和水平

按表1 的分析因素和水平，利用Design－Expert 10 软件进行节节草多糖提取工艺实验设计，共设计17 个实验点，得到实际结果如表2 所示.

表2 响应面实验设计与结果

2.2 模型方程的建立与显著性检验

利用Design－Expert 10 软件将表2 实验数据进行响应面分析：以节节草多糖提取率（Y）为效应值，分别对微波温度为（A），微波时间为（B），料液比为（C）3 个因素进行多元回归拟合，发现用二次阶多项式回归最优，软件得到的二次回归方程模型为

对拟合方程进行方差分析，结果见表3.

表3 回归模型方差分析结果

由表3 可以看出，该模型F＝30.18，P＜0.000 1，表明模型极显著. 模型的决定系数R2＝0.974 9，说明该模型与实际实验拟合较好，各个自变量与提取率响应值之间线性系显著. 因此，该回归方程对实验拟合情况较好，实验误差小，可以较好地描述各因素和响应值之间的真实关系.

从系数项P值来分析，方程的一次项C、交互项AC、二次项A2和B2都达到极显著水平，说明试验各个因素对响应值的影响并非简单的线性关系［11］.

F值可以反映各实验因素对实验指标的重要性，F值越大，表明对实验指标的影响越大； 从表3 可知，C＞A＞B，所以各个单因素对节节草多糖提取率的影响为料液比＞温度＞时间.

2.3 微波辅助提取工艺的响应面交互作用分析

节节草多糖提取率（Y）与自变量三维响应曲线面，如图1 所示. 微波温度（A）与微波时间（B）的底面等高线密度相差不大，表明AB的交互作用对微波提取节节草多糖的影响不够显著； 微波温度（A）与料液比（C）之间底面等高线密度最大，表明AC的交互作用对节节草多糖提取率的影响显著； 料液比（C）与微波时间（B）的底面等高线密度相差不大，表明BC的交互作用对节节草多糖提取率影响不够显著. 这与表3 中方差分析结果一致. 对模型方程求一阶偏导可得模型的最佳提取条件为：微波温度49.70℃，料液比1∶46.65 g／mL，提取时间15.55 min，微波提取节节草多糖的理论提取质量分数为4.188 98 mg／g.

图1 节节草多糖提取的三维响应面曲线面

2.4 响应面优化的最优提取条件的验证

根据Design－Expert 8.0.6.1 软件得到的数据回归方程结合实际情况可以得到的最佳提取工艺条件为：料液比1∶46.65 g／mL、微波温度49.70 ℃，微波时间15.55 min. 在上述的条件下多糖的理论提取率为4.19%，考虑到实际操作的便利，将提取最佳条件修正为料液比为1∶47 g／mL，提取时间为15 min，微波温度为50 ℃，平行实验3 次，多糖提取率为4.16%. 与预测值为4.19%相比，得到的实际测量值与理论值之间相对误差为－0.72%，表明实验结果与软件模拟给出的预测相一致.

图2 微波提取节节草多糖的红外光谱图

2.5 红外光谱分析

最佳条件提取的节节草多糖，经过除蛋白和醇沉进行纯化处理，获得的样品干燥后测得其红外光谱如图2.从图2 可以看出3 450 cm－1和2 930 cm－1应该分别属于节节草多糖－OH和C－H的伸缩振动吸收峰.1 732 cm－1、1 630 cm－1的吸收峰应归属于节节草多糖的羧基（COO－）的伸缩振动. 红外光谱的结果与多糖的主要官能团特征一致，结合节节草微波提取物可以采取苯酚－硫酸法进行显色的特征，可以确定微波提取的节节草成分应为多糖类物质.

3 结论

本实验利用微波辅助提取节节草中的多糖，选取料液比、微波时间、微波温度3 个因素进行单因素实验.根据单因素实验的结果，利用计算机软件Design－Expert 进行响应面法设计，优化了节节草多糖提取工艺. 模型的决定系数R2＝0.974 9，说明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著. 通过模型设计和实验探讨，确立了微波辅助节节草中多糖的最佳提取工艺：料液比为1∶47 g／mL，提取时间为16 min，微波温度为50 ℃. 该方法对节节草中多糖成分的提取和在食品、药品领域的应用研究具有一定的借鉴作用.