御唐丸对糖尿病胰岛素抵抗大鼠肝脏PI3K/AKT信号通路的影响

张良，何秀丽，郑南，井宏颖，韩玉生*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.哈尔滨体育学院，黑龙江 哈尔滨 150008)

2型糖尿病所引起的胰导素抵抗(IR)使机体对胰岛素的敏感性降低，临床上改善胰岛素抵抗的口服药如二甲双胍、罗格列酮和吡格列酮等存在各种副作用，不利于病人长期服[1-2]。临床与实验研究表明中药御唐丸可有效降糖、降脂，改善 2 型糖尿病患者的胰岛素抵抗，对糖尿病模型大鼠糖脂代谢具有明显的改善作用[3-6]。本文研究御唐丸对糖尿病大鼠肝脏组织中 PI3Kp85和AKT2 蛋白和基因表达的影响，进一步探讨其降糖的分子机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级Wistar大鼠80只，雄性，体质量(200±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(黑)2013-0004。自由饮食，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 药物及试剂

御唐丸由西洋参、山药、龟板、鹿茸、玉竹、葛根、乌梅、黄芪、麦冬、山萸肉、女贞子、白芍等组成，由黑龙江省中西医结合研究所制剂室生产；二甲双胍(北京京丰制药，批号：H11021518)；高糖高脂饲料由25%胆固醇、5%蛋黄粉、10%猪油、20%蔗糖、62.5%基础饲料等组成；链脲佐菌素(STZ),美国Sigma；胰岛素ELISA检测试剂盒、兔抗PI3Kp85和AKT2多克隆抗体，武汉博士德;PCR引物及抽提试剂等均由大连宝生物提供。

1.3 仪器

2135型组织切片机，德国菜卡；Moticam3000显微摄影成像系统，美国Motic； DNM-9602型酶标仪，北京普朗新技术有限公司；荧光定量PCR，美国ABI。

2 方法

2.1 模型制备及分组给药

实验前检测大鼠全血血糖，剔除血糖异常者，再随机分为正常组(10只)和高糖高脂喂养组(60只)，分别予以普通饲料和高糖高脂饲料喂养8周。高糖高脂组大鼠禁食禁水12 h后，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液，连续观察3 d。筛选空腹血糖≥16.7 mmol/L者为模型制备成功。将造模成功大鼠再随机分为模型组、二甲双胍组，御唐丸低、中、高剂量组，继续喂以高脂饲料。二甲双胍组灌胃给予浓度为0.2 g/kg的二甲双胍混悬液；御唐丸低、中、高剂量组分别灌胃给予浓度为 0.675、1.35、2.70 g/kg的御唐丸混悬液；正常组和模型组灌胃给予等体积的生理盐水。干预4周后处死大鼠，留取血清及肝脏组织。

2.2 指标检测

2.2.1 大鼠空腹血糖(FBG)测定

大鼠尾尖取血，采用微量血糖测定仪进行检测，分别于造模前、造模后和治疗后进行监测大鼠FBG变化。

2.2.2 大鼠空腹血清胰岛素(FINS)测定

各组大鼠在末次给药后禁食禁水12 h，取血分离血清，严格按ELISA试剂盒说明书操作。

2.2.3 胰岛素敏感系数(ISI)的测定

根据公式对各组大鼠ISI进行分析[7]，ISI=Ln[1/(FINS×FBG)]，即FBG与FINS乘积倒数的自然对数。

2.2.4 免疫组化法检测肝脏PI3Kp85a、AKT2蛋白表达

肝脏组织经常规石蜡包埋后切片，PV二步法检测PI3Kp85a、AKT2蛋白表达。Moticam3000显微摄影成像系统在400倍视野下摄影，每组每例随机选取3不同视野，采用Motic image 3.2图像分析软件进行分析，以平均灰度值代表蛋白含量的多少。

2.2.5 RT-PCR法检测PI3Kp85a、AKT2mRNA表达

液氮冻存的肝组织经研磨后，提取总RNA，采用RT-PCR法检测PI3Kp85a、AKT2mRNA表达。见表1。

表1 引物序列表

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 对大鼠空腹血糖(FBG)的影响

造模后各大鼠FBG显著升高，与空白组相比较，有显著性差异(P<0.01)；治疗后各治疗组FBG均有不同程度的降低，与模型组相比较，有显著性差异(P<0.01)，其中以御唐丸高剂量组降低最为明显。见表2。

表2 各组大鼠FBG比较

3.2 对大鼠空腹血清胰岛素(FINS)的影

与空白组相比较，模型组FINS水平明显降低，有显著性差异(P<0.01)；各治疗大鼠FINS均有不同程度的升高，与模型组相比较，有显著性差异(P<0.01)其中以御唐丸高剂量组升高最为明显。见表3。

表3 各组大鼠FINS比较

3.3 对大鼠胰岛素敏感系数(ISI)的影响

模型组大鼠胰岛素敏感系数明显降低，与空白组相比较，有显著性差异(P<0.01)；各治疗大鼠胰岛素敏感系数均有不同程度的升高，与模型组相比较，有显著性差异(P<0.01)其中以御唐丸高剂量组升高最为明显。见表4。

表4 各组大鼠ISI比较

3.4 对大鼠肝脏PI3Kp85a、AKT2蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，PI3Kp85a、AKT2蛋白主要表达在肝细胞胞质中，阳性表达呈黄色或棕黄色颗粒状。模型组大鼠肝组织中PI3Kp85a、AKT2蛋白相对含量明显减少，与空白组相比较，有显著性差异(P<0.01)；各治疗大鼠肝组织中PI3Kp85a、AKT2蛋白相对含量均有不同程度的增加，与模型组相比较，有显著性差异(P<0.05或0.01)其中以御唐丸高剂量组升高最为明显。见表5。

表5 PI3Kp85a、AKT2免疫组织化学染色平均灰度值比较

3.5 对大鼠PI3Kp85a、AKT2mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，模型组大鼠肝组织中PI3Kp85a、AKT2mRNA表达明显减少，与空白组相比较，有显著性差异(P<0.01)；各治疗大鼠肝组织中PI3Kp85a、AKT2mRNA表达量均有不同程度的增加，与模型组相比较，有显著性差异(P<0.01)其中以御唐丸高剂量组升高最为明显。见表5。

表5 治疗后各组大鼠PI3Kp85amRNA、AKT2mRNA表达

4 讨论

现代医学研究表明，糖尿病及其并发症发生发展的病理基础是机体内糖脂代谢障碍[8-9]，不良的饮食习惯和生活方式是诱发糖尿病发病率逐年上升的重要原因，由于过量摄入高糖高脂食物，使机体脂质代谢紊乱，导致胰岛抵抗(IR)的发生[10]。IR是指机体中胰岛素的生理效应降低，或各种原因引起的组织对胰岛素反应能力下降。本实验采用高糖高脂饲料结合STZ诱导大鼠糖尿病模型，模拟人类2型糖尿病IR的病理过程，结果显示FBG水平明显升高，FINS水平明显降低，胰岛素敏感系数明显降低，表明此方法制备的大鼠2型糖尿病模型产生了明显的胰岛素抵抗。经御唐丸治疗后，FBG水平有不同程度的降低，FINS水平也有不同程度的升高，胰岛素敏感系数明为增强，表明御唐丸对胰岛素抵抗具有显著的改善作用。

胰岛素必须与相应的受体结合后，激活相关的级联酶促反应，产生一系列的细胞内信号转导，才能最终发挥其生理效应[11]，其中PI3K/AKT信号途径是调控胰岛素水平的主要信号通路之一。正常情况下，胰岛素与其受体结合后，活化酪氨酸激酶产生自磷酸化，进而促进SH2与PI3Kp85结合并活化PI3K ，经过一系列催化过程激活AKT，激活的 AKT使下游的GSK-3β磷酸化，肝脏中肝糖原的合成增加，维持机体血糖的正常水平[12-13]。糖尿病时胰岛素抵抗状态下，胰岛素水平或者效能不足，GSK -3β磷酸化减少，使肝糖原含量下降，导致体内血糖水平升高[14]。本实验结果显示，模型组大鼠肝组织中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表达量均显著下调，御唐丸低、中、高剂量组大鼠肝组织中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表达量均有不同程度的上调。提示御唐丸可以通过激活 PI3K/Akt 信号通路，改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗状态，进而发挥治疗糖尿病的作用。