湖北钉螺指名亚种一输入性扩散事件的群体遗传学

蒋奉娟，刘卉萌，陈海婴，彭国华，周宪民，邹节新

(1.南昌大学1a.基础医学院，江西 南昌 330031；1b.鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌市疾病预防控制中心，江西 南昌 330000)

湖北钉螺(Oncomeania hupensis)系日本血吸虫的唯一中间宿主，在血吸虫病的流行过程中具有重要作用,其分布直接决定着血吸虫病的流行范围。世界范围内，湖北钉螺主要分布于中国、日本、菲律宾、印尼等国家和地区[1]。由于地质变迁，湖北钉螺被隔离分化为多个亚种或具有明显地域格局特色的地理群体[2]，其中分布于长江中下游地区的指名亚种分布广泛，种群规模大，孳生环境多样、遗传分化复杂[3]，且因传播血吸虫病对人群威胁最大[4]。由于长江水系洪水频发，湖北钉螺指名亚种在空间上呈连续分布格局，基因交流频繁，遗传结构复杂，表现出种群水平的遗传变异[5]。与此同时，长江中下游地区钉螺的顺水扩散、人为输入、新螺区的形成等因素加大了该区域湖北钉螺指名亚种群体遗传结构的复杂性，对当地血吸虫病的防治带来挑战。

南昌市疾病预防控制中心2017年开展赣江流域螺情年度例行性调查时，于西湖区朝阳滨江公园赣江江滩约14.8万平方米范围内发现较多数量的钉螺分布。既往的调查报告表明，湖北钉螺在南昌市仅分布于南昌县、新建县、高新区、安义县等地[6]，在市区发现大范围的钉螺种群为首次。流行病学初步调查结果显示，该区域2015年起因城市化改造移栽来自武汉黄陂区的景观芦苇，此次出现的钉螺种群可能因芦苇移栽导致人为输入。为证实该结果，本研究获取了南昌市滨江公园、武汉市黄陂区、上饶市玉山县、九江市星子县等地标本，采用线粒体12S rRNA、16S rRNA、CO1及其联合基因的分子数据，结合GenBank中已公布序列信息，对南昌市滨江公园输入性湖北钉螺群体进行群体遗传分析，初步探究其遗传背景。

1 材料方法

1.1 标本采集与数据来源

本实验室已取得来自江西省九江市星子县、上饶市玉山县、南昌市滨江公园和湖北省武汉市黄陂区湖北钉螺标本(采集地信息见表1)。形态学观察发现三地钉螺标本均为肋壳钉螺，无明显差异，不易区分(图1)。逸蚴法挑选出无血吸虫感染成年钉螺个体用于本研究。结合Genbank中已有序列信息，根据样本采样地地理分布特点，将所有研究种群分为10个组(表2、图1)。

表1 标本采样地点信息表

表2 数据来源信息表

续表2 数据来源信息表

1.2 DNA提取、PCR扩增、基因序列测定

分离酒精固定的钉螺肌肉组织，干燥24 h，使用OMEGA试剂盒(北京百泰克公司)，提取基因组DNA。参照文献[2,7-8]设计PCR扩增引物。PCR反应体系为30 μL，包括10.5 μL ddH2O，15 μL 2×Es Taq Maste Mix，1.5 μL primer，3 μL模板DNA。各基因PCR扩增条件如下：16S rRNA：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s，12S rRNA：50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共30个循环，72 ℃延伸10 min；CO1：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性40 s、56 ℃退火65 s、72 ℃延伸2 min 30s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，选择条带清晰明亮、无杂带、无拖尾且符合目标长度的产物进行纯化、外送公司测序。

1.3 分子数据处理和分析

将测序公司返回的3个基因序列进行人工拼接，DNA Star软件包Seqman程序进行碱基检查，Mafft软件进行比对，Gblock软件包本地选择序列的保守区。(12S rRNA序列由于长度较短，未选择保守区)利用Sequence Matrix[9-10]软件联合同一个体的CO1、12S rRNA、16S rRNA3个基因序列，PAUP4.0软件进行同质性检验，检测不同基因联合分析的可行性[11]；Mega 7软件基于K-2-P法计算联合基因各群组间遗传距离[12]；DNA sp软件选择各基因单倍型[13-14]；Alrequin软件计算遗传分化系数和基因流；Network软件绘制单倍型网络图[15]。

2 结果

2.1 序列特征分析

本研究分别获得湖北钉螺12S rRNA基因76条，16S rRNA基因80条，CO1基因57条，基因序列长度分别为356，503和604 bp。12，16S rRNA和CO1的C+G含量分别32.4%，33.8%，41.6%，A+T含量分别为67.6%，66.2%，58.4%。C+G含量明显低于A+T含量，符合无脊椎动物线粒体DNA序列的普遍特点[16,17]。将南昌滨江公园未知种群上述3种基因序列分别在GenBank中进行Blast，结果均显示其与湖北钉螺指名亚种有较高的同源性。结合GenBank中已公布的湖北钉螺线粒体基因序列信息，共获得186条12S rRNA基因序列，136条16S rRNA基因序列和402条CO1基因序列。

2.2 遗传距离分析

不同基因计算出的长江中下游地区指名亚种的遗传距离为0.001～0.022。各基因遗传距离的结果存在一定差异：三基因联合、线粒体16S rRNA结果显示来自滨江公园的C组与来自鄱阳湖地区的D组间遗传距离最小，分别为0.005，0.002，而线粒体12S rRNA、CO1基因的结果显示来自滨江公园的C组与来组武汉的B组间遗传距离最小，分别为0.002，0.010(表3～6)

表3 基于线粒体12S rRNA基因构建湖北钉螺不同群组间的遗传距离

表4 基于线粒体16S rRNA基因构建湖北钉螺不同群组间的遗传距离

表5 基于线粒体CO1基因构建湖北钉螺不同群组间的遗传距离

表6 基于三者联合基因构建湖北钉螺不同群组间的遗传距离

2.3 遗传分化分析

基于不同基因的遗传分化研究结果均大体呈现亚种间大于亚种内的遗传格局。CO1基因及12S、16S、CO1三者联合的基因计算结果均显示来自滨江公园的C组与来自武汉的B组间遗传分化水平最低(Fst分别为0.063 08，0.064 46)，基因流最大,两群体间处于中度分化水平，基因交流显著(Nm>4)遗传背景相似。基于16S rRNA的结果显示，虽然来自滨江公园的B组与来自武汉的C组间处于中度分化水平(Fst=0.139 85)，但是其与来自鄱阳湖流域的D组间Fst更小(Fst=0.126 44)，而12S rRNA结果则显示C组与来自山区地区的E组间Fst更小，基因交流更显(表7～10)。

表7 湖北钉螺联合基因群组间的遗传分化系数Fst(左下角)和基因流(右上角)

表8 湖北钉螺12S rRNA基因群组间的遗传分化系数Fst(左下角)和基因流(右上角)

表9 湖北钉螺16S rRNA基因群组间的遗传分化系数Fst(左下角)和基因流(右上角)

表10 湖北钉螺CO1基因群组间的遗传分化系数Fst(左下角)和基因流(右上角)

2.4 单倍型网络图

单倍型网络图可以直观展现湖北钉螺个体间单倍型的演化情况，图中每一种颜色代表一个地理群体，两个单倍型间的空心节点表示丢失的单倍型，圆圈的大小代表单倍型的个体数(图3～6)。12S rRNA、16S rRNA、COI基因及其三者联合基因构建的单倍型网络图均表现为长江中下游指名亚种种群聚为一支。基于三基因联合构建的单倍型网络图显示，来自滨江公园的C组未与任何群体形成共享单倍型，但与来自武汉的B组其单倍型具有直接或较近的演化关系；在CO1基因构建的单倍型网络图中，来自滨江公园的C组与来自武汉的B组间形成一个共享单倍型，且各独享单倍型间有直接演化关系，可通过1～3步突变形成。基于12S rRNA和16S rRNA基因构建的单倍型网络图均显示：C组与B、D、E形成一个共享单倍型，C组的独有单倍型与该共享单倍型间的演化关系密切。

3 讨论

湖北钉螺的输入性扩散与顺水流扩散、洪水、人为输入等因素有关[18]，其中人为输入的不可控因素最多、监测难度最大，当新发螺区具备适宜的地质条件、气候条件等生态因素时，输入性钉螺更易在此繁殖扩散。本研究基于江西省南昌市滨江公园这一湖北钉螺输入性扩散事件，运用线粒体基因作为分子标记，计算群体遗传学相关参数，探究了该群体的扩散来源。

3.1 滨江公园湖北钉螺输入来源来源的群体遗传学分析

线粒体基因具有丰富的系统发育信号，既可以反应古老的系统发生关系亦可以反应近期的改变[19]。在湖北钉螺的研究中，线粒体基因以其特有的优越性而广泛应用于湖北钉螺遗传多样性、地理群体遗传学等领域的研究中[20-21]，其中16S rRNA及CO1基因应用最为广泛，但以12S rRNA基因作为分子标记的研究相对匮乏。Saijuntha等人利用线粒体12S rRNA基因探究了湖北钉螺菲律宾亚种的遗传分化结构，结果表明该亚种不同地域间的遗传分化显著，其遗传分化受地理因素影响明显[22]；MUNEHIRO OKAMOTO等利用12S rRNA分析了钉螺的系统发育关系，不同亚种在系统发育树上呈现独立的分枝，同时与拟钉螺成为姐妹枝[7]，与以往研究结果相似，说明该分子标记可用于湖北钉螺遗传分化的研究，但其在GenBank数据库中的序列信息却相对匮乏。本研究利用上述3种分子标记，探究其对湖北钉螺输入性种群来源分析中的的应用价值。

各基因计算出的种群间的遗传距离距符合郭平仲提出的同一物种地区种群内的遗传距离[23]，但同一物种亚种内及亚种间遗传距离的差异尚不显著。由于该钉螺种群在滨江公园赣江流域洲滩的生存时间较短，其遗传物质尚未产生显著的差异，因此可用遗传分化系数追溯与其亲缘关系较近的群体。联合基因与CO1基因所得结果均显示，滨江公园群体(C组)与湖北武汉群体(B组)间存在较高程度的基因交流，遗传背景相似。线粒体12S rRNA和16S rRNA基因的结果虽有差异，但是滨江公园群体(C组)与其他组间的遗传分化系数相差不大，可能由于各组内序列数量较少，部分群组间的遗传分化系数不具有统计学意义，由此导致不同基因分析结果的差异，仍需补充湖北钉螺指名亚种各群组内的序列信息，进一步研究。因为联合基因包含更多的遗传信息，CO1基因各组的序列信息较丰富，其结果应具有更高可靠性。

对于湖北钉螺亚种内的不同群体而言，其遗传分化较低，近期的突变较小，个体间重组频繁加之广泛的基因交流，使得二分法构建的系统发育树不能准确反应其实际的基因分化情况，此时，单倍型网络图能够更准确的反应亚种内单倍型间的演化关系[15]。基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因构建的单倍型网络图均显示B、C、D、E群体间存在一个共享单倍型，可能为上述4个群体间的祖先单倍型。其原因为：上述4个组群均位于长江中游的干流和支流，存在基因交流，且线粒体12S rRNA和16S rRNA基因进化速度较，且序列短，包含变异位点少，仅反映出历史事件对线粒体基因的影响，因此滨江公园种群与其他种群间的单倍型演化并非独立。而CO1基因包含更多变异位点，进化速率更快，对环境差异的敏感性更高，滨江公园种群在单倍型网络图中与武汉黄陂种群的单倍型间有直接的演化关系或通过缺失单倍型相连。综上所述，从分子层面可以证明“南昌市滨江公园输入性湖北钉螺群体可能由移栽自武汉市黄陂区的景观芦苇携带而来”的流行病学调查结果。

3.2 滨江公园湖北钉螺扩散滋生的生态因素分析

南昌市滨江公园新发螺区位于赣江流域东岸洲滩，2015年该区域曾进行城市化改造，移栽了来自武汉黄陂区的景观芦苇，钉螺种群可吸附于芦苇输入至南昌市区。卫星地图显示2014年滨江公园赣江洲滩土地裸露无植被覆盖，到2016年该区域已经被植被覆盖，适合钉螺滋生繁殖(图7)。该地处鄱阳湖螺区与丰城县历史血吸虫病重疫区之间[24]，具备适宜地质条件[25-26]，同时，气温等环境因素也为输入性钉螺种群的滋生提供了条件。2016年12月至2017年2月江西省平均气温9.7 ℃，较同期气温偏高2.3 ℃，为1961年来最强的一个暖冬，冬季较高的温度为钉螺的孳生繁衍提供了极其有利的条件。

4 结论

本研究，对滨江公园湖北钉螺种群输入性扩散事件进行了群体遗传学分析，验证了南昌滨江公园新发现的湖北钉螺种群与武汉黄陂种群间具有较近的亲缘关系，支持疾控部门对其来源于移栽自武汉黄陂区的芦苇中的推测，丰富了GenBank中湖北钉螺线粒体12S rRNA基因序列信息，同时表明线粒体CO1基因能够提供较丰富的信息以追溯湖北钉螺未知群体的来源。本研究结果提示，需对南昌朝阳滨江公园新发现的有螺区域按照我国现行血吸虫与血吸虫病的防治管理办法进行连续不间断追踪与严格监控，以防止有螺区紧急扑灭后可能出现的死角及其残余钉螺的死灰复燃。