原发性肝细胞癌中Ezrin和Survivin的表达及其与淋巴结转移的关系*

韦花媚，陆海善，韦仕喜，黎俊楠，黄群芳

（右江民族医学院附属医院 病理科，广西 百色 533000）

原发性肝细胞癌为一种常见的消化系统恶性肿瘤，在发达国家中的病死率居各类恶性肿瘤的前列[1]。随着对肝癌发病机制的深入研究，发现肝癌细胞淋巴结转移是造成患者死亡的主要原因之一，因此，研究与肝癌细胞淋巴结转移相关基因蛋白表达变化可为肝癌的诊疗提供可靠的生物标志物[2]。Ezrin 属ERM（ezrin,radixin,moesin）成员，为膜细胞骨架连接蛋白，不仅在细胞的运动、迁移、黏附、有丝分裂等生理功能中起关键作用，还参与多种恶性肿瘤的淋巴结转移[3]。研究表明[4]，Ezrin 主要通过调节信号传导和黏附分子的途径参与细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用。Survivin 属凋亡抑制因子家族，在抗凋亡机制中发挥重要作用，特异性表达于细胞的G2/M 期，且仅在肿瘤恶性转化的早期表达，可有效促进部分损伤恶性转化，但其具体的活化机制尚未阐明[5]。本研究通过检测原发性肝细胞癌前病变组织和原发性肝细胞癌组织Ezrin 和Survivin 的表达水平，探讨二者与原发性肝细胞癌浸润和淋巴结转移的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月—2018年5月右江民族医学院附属医院接受手术切除的98 例原发性肝细胞癌患者的癌组织标本。其中，男性68 例，女性30 例；年龄46～85 岁，平均（67.52±6.48）岁；病程1～7年，平均（4.21±3.75）年。98 例患者中，淋巴结转移58例（有淋巴结转移组），无淋巴结转移40 例（无淋巴结转移组）。9 例肝组织正常标本采自正常肝组织（正常对照组）。按Edmondson 法[6]进行分级，根据肿瘤形态和分化程度分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级10 例，均无淋巴结转移；Ⅱ级36 例，其中，20 例有淋巴结转移，16 例无淋巴结转移；Ⅲ级38 例，其中，24 例有淋巴结转移，14 例无淋巴结转移；Ⅳ级14 例，均有淋巴结转移。以上标本均经病理检查核实。

1.2 主要试剂

Ezrin 鼠抗人单克隆抗体购自武汉博士德公司，Survivin 兔抗人单克隆抗体购自福州迈新公司。

1.3 操作方法

所有标本用10%甲醛固定后常规石蜡包埋，4 μm连续切片，最后进行苏木精-伊红（HE）染色、SP 免疫组织化学染色及光学显微镜观察。根据SP 试剂盒说明书步骤进行操作，一抗浓度为1 ∶500，分别与阳性对照比较。磷酸盐缓冲溶液（PBS）替代一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

分别用高倍镜和低倍镜观察切片，细胞膜或细胞质内出现棕黄色颗粒为Ezrin 及Survivin 蛋白阳性表达。每个切片随机选择5 个高倍视野观察，根据染色强度和阳性细胞数所占百分比计分。染色强度：无色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分；阳性细胞数：≤5%计0 分，＞5%～25%计1 分，＞25%～50%计2 分，＞50%计3 分。最后计算染色强度与阳性细胞数得分的乘积，0 分为（-），1、2、3 分为弱阳性（+），4、5 分为中度阳性（++），6 分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件，计数资料以率（%）表示，3 组资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原发性肝细胞癌组织与正常肝组织中Ezrin表达的比较

Ezrin 阳性表达于细胞质或细胞膜上，在原发性肝细胞癌组织中呈片状弥散分布，主要为弱阳性至中度阳性表达（见图1）。正常对照组、无淋巴结转移组与有淋巴结转移组Ezrin 阳性表达率分别为33.3%、42.5%和69.0%，3 组比较差异有统计学意义（χ2=8.795，P=0.012）；有淋巴结转移组Ezrin 的阳性表达水平高于无淋巴结转移组（χ2=6.814，P=0.009）；无淋巴结转移组Ezrin 阳性表达水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（χ2=0.256，P=0.613）。见表1。

图1 正常肝组织和原发性肝细胞癌组织中Ezrin 蛋白的表达 （SP ×200）

表1 3 组Ezrin 阳性表达率的比较

2.2 原发性肝细胞癌组织与正常肝组织中Survivin 表达的比较

Survivin 阳性表达于细胞质，在原发性肝细胞癌组织中呈片状弥散分布，主要为中至强阳性表达（见图2）。正常对照组、无淋巴结转移组与有淋巴结转移组Survivin 阳性表达率分别为0.0%、50.0%和84.5%，3 组比较差异有统计学意义（χ2=30.134，P=0.000）；有淋巴结转移组Survivin 的阳性表达水平高于正常对照组和无淋巴结转移组（χ2=28.302 和13.510，均P=0.000）；无淋巴结转移组Survivin 阳性表达水平高于正常对照组（χ2=7.603，P=0.006）。见表2。

图2 正常肝组织和原发性肝细胞癌组织中Survivin蛋白的表达 （SP ×200）

表2 3 组Survivin 阳性表达率的比较

2.3 Ezrin、Survivin 表达与原发性肝细胞癌临床分级的关系

Ⅰ～Ⅳ级的原发性肝细胞癌Ezrin 与Survivin 的表达差异无统计学意义（P＞0.05），提示Ezrin 与Survivin表达与原发性肝细胞癌的临床分级无关。见表3。

2.4 Ezrin、Survivin 表达的相关性

Spearman 相关性分析显示，有淋巴结转移的肝细胞癌组织中，Ezrin 与Survivin 的表达呈正相关（rs=0.458和0.489，均P=0.000）。

表3 不同临床分级Ezrin 和Survivin 阳性表达的比较 例

3 讨论

通过加强对肝癌分子病理机制的研究，找出与肝癌发生、发展、复发与淋巴结转移相关的关键调控因素具有十分重要的临床意义。越来越多的研究表明[7]，细胞骨架连接蛋白Ezrin 和细胞黏附分子是影响细胞黏附功能和肿瘤细胞恶性进展的重要物质。Ezrin 在肿瘤发展、浸润和淋巴结转移进程中发挥关键作用[8-9]。有文献报道[10]，Ezrin的表达决定恶性肿瘤的吞噬功能，而吞噬功能则与恶性肿瘤淋巴结转移密切相关。本研究发现，有淋巴结转移组Ezrin 的表达水平高于无淋巴结转移组，说明Ezrin 与肿瘤的进展过程关系密切，其表达随着恶性程度的增加呈上升趋势。

Surivivin 蛋白是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，Survivin 具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织中，且与肿瘤的分化增殖、浸润程度、淋巴结转移存在密切关联[11]。Survivin 属凋亡抑制因子家族，定位于17q25 染色体，编码143 个氨基酸；其独特之处在于仅有一个氨基酸Zn2+结合的BIR 区，由一个卷曲螺旋结构代替缺乏缩氨酸的指环结构，而该结构与Survivin 的抗凋亡机制关系密切[12]。研究表明[13]，正常成人组织除了胎盘和胸腺，其他组织的Survivin 含量较低，而在肿瘤细胞中Survivin mRNA 和蛋白呈高表达状态。结肠息肉、鲍恩病、乳腺腺瘤等癌前病变中也出现Survivin 的表达，提示Survivin 可出现于肿瘤恶性转化的早期，并参与恶性损伤转化的整个进程，但具体的参与方式尚不清楚。本研究中，有淋巴结转移组Survivin 的表达水平高于正常对照组和无淋巴结转移组；无淋巴结转移组Survivin 表达水平高于正常对照组，说明Survivin 与肿瘤的进展过程关系密切，其表达随着恶性程度的增加呈上升趋势，与文献研究结果相符[14]。另外，本文发现Survivin 蛋白在原发性肝细胞癌组织中呈过量表达的形式，推测Survivin 的异常表达可能发生于原发性肝细胞癌的早期阶段。分析其原因可能为原发性肝细胞癌早期阶段通过抑制细胞凋亡，而一些存在缺陷的基因细胞会继续不停地生长，从而促进基因突变的聚集，进而使细胞发生恶性转化，诱导原发性肝细胞癌的发生。分析Survivin 蛋白的表达与临床病理的相关性，结果发现Survivin 与淋巴结转移存在密切关联，随淋巴结转移，Survivin 蛋白水平呈高表达，高表达的Survinvin 参与肿瘤细胞的生长及淋巴结转移。

原发性肝细胞癌转移的主要途径是淋巴结转移，可在早期出现，是原发性肝细胞癌判断预后的重要因素之一。本研究中，原发性肝细胞癌Ⅰ～Ⅳ级患者Survivin 的表达水平无差异，说明Survivin 的表达水平与临床分级无关。而淋巴结转移组的Survivin 的表达水平高于无淋巴结转移组，提示Survivin 的表达与淋巴结转移关系密切。

综上所述，Ezrin 与Survivin 在原发性肝细胞癌中的高表达与原发性肝细胞癌的侵袭性行为关系密切，可作为评估早期原发性肝细胞癌预后的指标之一。